[發(fā)明專利]一種篩查紅系轉(zhuǎn)錄因子EKLF基因突變的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111136730.0
• 申請日: 2021-09-27
• 公開（公告）號: CN113621700B
• 公開（公告）日: 2023-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉頓;余麗華;劉風(fēng)華;張曦倩
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 沈陽亞泰專利商標(biāo)代理有限公司 21107
• 代理人: 史力伏

1.一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的PCR引物組，其特征在于，所述引物組包括9對引物，詳述如下：

（1）EKLF基因啟動子區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；

（2）EKLF基因外顯子1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；

（3）EKLF基因外顯子2-1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

（4）EKLF基因外顯子2-2區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；

（5）EKLF基因外顯子2-3區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；

（6）EKLF基因外顯子2-4區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；

（7）EKLF基因外顯子3區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；

（8）EKLF基因3'UTR-1區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；

（9）EKLF基因3'UTR-2區(qū)域上下游引物分別為：SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。

2.一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的檢測反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系含有權(quán)利要求1所述的一組或幾組的PCR引物組。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包括陰性質(zhì)控品、PCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、LC Green、Betain、去離子水和DMSO；所述dNTPs混合物包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測反應(yīng)體系，其特征在于，所述DNA聚合酶為廣州鼎國生物Taq DNA聚合酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測反應(yīng)體系，其特征在于，所述Betain為5M。

6.一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1所述的一組或幾組的PCR引物組。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含權(quán)利要求3所述的檢測反應(yīng)體系。

8.一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括如下步驟：

（1）待測樣本DNA準(zhǔn)備：采集被檢測者外周血標(biāo)本，采用柱式法提取樣本DNA；

（2）高分辨率熔解曲線反應(yīng)體系：

10μLPCR反應(yīng)體系包括:10×Taq buffer（含20mMMg2+）1.0μL，2.5nM dNTPs 0.4μL，5U/μlTaq DNA聚合酶0.2μL，10μM上下游引物0.6μL，1×LC Green 1μL，模板DNA0.8μL，5MBetain 2.0μL，DMSO 1.0μL，去離子水3.0μL；

（3）PCR反應(yīng)程序：

按照特定的循環(huán)條件在PCR儀上進(jìn)行，95℃預(yù)變性5分鐘；95℃ 30秒，63-68℃ 30秒，72℃ 30秒，共45個循環(huán)；95℃ 1分鐘，4℃保溫；

（4）PCR擴(kuò)增完成后在高分辨率熔解曲線分析儀（LightScanner HRⅠ96）上進(jìn)行檢測熒光，起始溫度為55℃，終止溫度為98℃和待機(jī)溫度為42℃；橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為相對熒光強(qiáng)度。

9.一種以高分辨率熔解曲線技術(shù)為基礎(chǔ)檢測EKLF基因突變的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在檢測樣本中EKLF基因突變中的應(yīng)用。