[發明專利]高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202111118593.8
• 申請日: 2021-09-24
• 公開（公告）號: CN113913356A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 徐慶陽;劉云鵬
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/52;C12N15/77;C12N15/69;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明提供了一種高產L?谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株及其構建方法與應用，所述谷氨酸棒桿菌通過菌株TCCC 11822經過五步改造獲得，相比原菌株TCCC 11822L?谷氨酰胺產量提高了74.9％、副產物谷氨酸降低了67.4％，GS酶活大幅度提高，糖酸轉化率達到37.1％；所述構建方法通過敲除谷氨酰胺酶基因Ncgl2395和Ncgl2500，阻斷谷氨酰胺生成谷氨酸和NH₄⁺，谷氨酸作為谷氨酰胺發酵過程中的主要副產物，在提取過程中較難與谷氨酰胺分離，因此降低發酵液中谷氨酸的含量，可以大大降低谷氨酰胺提取難度，降低成本，具有廣泛的工業應用前景。

技術領域

本發明涉及發酵工程技術領域，尤其是高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株及其構建方法與應用。

背景技術

L-谷氨酰胺(L-Glutamine,L-Gln)化學名為2,5-二氨基-5-氧代戊酸，分子式為C₅H₁₀N₂O₃，相對分子量為146.15，結晶形狀為白色斜方晶體或結晶性粉末狀，無臭，有獨特的甜味。易溶于水，幾乎不溶于乙醇，氯仿等多種有機溶劑，熔點為185℃，等電點為5.65，具有熱不穩定性，遇熱或酸堿易變性。L-谷氨酰胺含有兩個氨基，一個是α-氨基，一個是末端酰胺基。由于末端酰胺基易水解，使谷氨酰胺不僅是生物體內嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、核酸和其他氨基酸生物合成的必須原料之一，還是各器官間氮流動的重要載體。

谷氨酰胺(L-Glutamine，L-Gln)是L-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一種中性氨基酸，是構成生物體蛋白質的20種基本氨基酸之一，在維持人體機能和生命活動方面具有重要作用，其在人體內含量非常高，占人體游離氨基酸的61％。近年來，隨著對L-谷氨酰胺的深入研究，L-谷氨酰胺被廣泛應用于醫藥、保健食品、飼料等領域。作為一種具有潛力的新藥，L-谷氨酰胺在臨床上主要應用于治療胃腸潰瘍，緩解運動疲勞，改善腦神經機能等方面。隨著對L-谷氨酰胺生理作用以及應用范圍的深度研究，谷氨酰胺的需求量和生產量都在不斷增加，且藥用需求量很大，具有廣闊的市場前景。谷氨酰胺的工業生產方法主要有化學合成法，酶法和發酵法，其中發酵法生產谷氨酰胺是目前使用的主要方法。

L-谷氨酰胺生產菌大多是由L-谷氨酸生產菌經誘變或基因工程改造而來。1963年，木下祝郎等發現在谷氨酸的發酵液中發現了少量谷氨酰胺。1979年，中西透等人通過進一步研究證實，可以改變發酵條件，使谷氨酸生產菌生產谷氨酰胺。谷氨酸為谷氨酰胺的直接前提物質，在高濃度NH₄⁺和微酸環境下，谷氨酸經谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)催化消耗ATP生成谷氨酰胺。目前用來生產谷氨酰胺的菌株主要包括：谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酞乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、北京棒狀桿菌(C.pekinense)、黃色短桿菌((B.flavun)、乳糖發酵短桿菌(B.revibacterium lactofentum)及鈍齒桿菌(C.crenatum)等。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株。

本發明所要解決的技術問題在于提供上述高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株的構建方法。

本發明所要解決的技術問題在于提供上述高產L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株的應用。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：