[發(fā)明專利]高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111118593.8
• 申請日: 2021-09-24
• 公開（公告）號: CN113913356A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐慶陽;劉云鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/55;C12N15/52;C12N15/77;C12N15/69;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

1.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-1，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：以谷氨酸棒桿菌CGMCCNo.1.16145為出發(fā)菌株，敲除谷氨酸合酶基因Ncgl0181，阻斷谷氨酰胺與α-酮戊二酸生成兩分子谷氨酸，構(gòu)建出菌株T-1。

2.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-2，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：以谷氨酸棒桿菌CGMCCNo.1.16145為出發(fā)菌株，敲除谷氨酰胺酶Ncgl2395基因，阻斷谷氨酰胺生成谷氨酸，構(gòu)建出菌株T-2。

3.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-3，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：以谷氨酸棒桿菌CGMCCNo.1.16145為出發(fā)菌株，同時敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，構(gòu)建出菌株T-3。

4.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-4，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：在菌株T-3的基礎(chǔ)上，在基因組Ncgl0182位點(diǎn)上整合了一拷貝的來自枯草芽孢桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_bsu，構(gòu)建出菌株T-4。

5.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-5，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：在菌株T-4的基礎(chǔ)上，在基因組Ncgl2500位點(diǎn)上整合了一拷貝的來自嗜酸乳桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_lcb，構(gòu)建出菌株T-5。

6.一種高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株，其特征在于：為谷氨酸棒桿菌菌株T-6，是通過菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，獲得方法如下：在菌株T-5的基礎(chǔ)上，使用帶有tuf強(qiáng)啟動子的pXT01質(zhì)粒，將來自枯草芽孢桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_bsu插入pXT01質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒pXT01-glnA_bsu，并將pXT01-glnA_bsu電轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株T-5，構(gòu)建出菌株T-6。

7.權(quán)利要求1-6所述高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)以谷氨酸棒桿菌CGMCC No.1.16145為出發(fā)菌株，敲除谷氨酸合酶基因Ncgl0181，阻斷谷氨酰胺與α-酮戊二酸生成兩分子谷氨酸，構(gòu)建出菌株T-1；

(2)以谷氨酸棒桿菌CGMCC No.1.16145為出發(fā)菌株，敲除谷氨酰胺酶Ncgl2395基因，阻斷谷氨酰胺生成谷氨酸，構(gòu)建菌株T-2；

(3)以谷氨酸棒桿菌CGMCC No.1.16145為出發(fā)菌株，同時敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，構(gòu)建菌株T-3，通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因?qū)劝滨０钒l(fā)酵的影響；

(4)在菌株T-3的基礎(chǔ)上，在基因組Ncgl0182位點(diǎn)上整合了一拷貝的來自枯草芽孢桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_bsu，構(gòu)建菌株T-4；在菌株T-4的基礎(chǔ)上，在基因組Ncgl2500位點(diǎn)上整合了一拷貝的來自嗜酸乳桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_lcb，構(gòu)建菌株T-5；

(5)在菌株T-5的基礎(chǔ)上，使用帶有tuf強(qiáng)啟動子的pXT01質(zhì)粒，將來自枯草芽孢桿菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA_bsu插入pXT01質(zhì)粒，構(gòu)建質(zhì)粒pXT01-glnA_bsu，并將pXT01-glnA_bsu電轉(zhuǎn)化進(jìn)入菌株T-5，構(gòu)建出菌株T-6。