[發明專利]一種規模化制備雞胚成纖維細胞的方法

在審

• 申請號: 202111052565.0
• 申請日: 2021-09-09
• 公開（公告）號: CN113789297A
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 崔松奇;魏文江;田春利;姚沾沾;余海濤;張丹丹;李娥;張娜;李曉靜
• 申請（專利權）人: 豪威生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/073
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：包括以下步驟，

(1)挑選雞胚并進行初步消毒：在雞胚前孵化室通過照胚挑選發育良好的多枚SPF雞胚，將雞胚送入消毒室，使用消毒液噴霧消毒雞胚表面，之后將雞胚轉移至溫室內；

(2)對雞胚進行再次消毒：將雞胚從溫室中取出，用刷子蘸取碘酒并對雞胚上部進行消毒，待碘酒晾干后，使用無水乙醇進行雞胚脫碘；

(3)取雞胚：打開雞胚氣室部位，將雞胚取出，放入平皿中；

(4)處理雞胚：采用工具夾取并去除雞胚的眼睛；

(5)清洗雞胚：將雞胚加入清洗器中，將漢克氏液注入清洗器中，搖晃雞胚清洗器使雞胚與漢克氏液充分混合，之后將清洗器中的漢克氏液吸出，如此重復清洗雞胚多次；

(6)消化雞胚：把清洗后的雞胚倒入磁力消化瓶中，高轉速攪拌令消化瓶中的雞胚全部打碎，成為糊狀懸浮組織，之后調至低轉速攪拌并加入胰酶，在胰酶的作用下，充分消化雞胚組織；

(7)組織細胞離心：消化好的雞胚懸浮組織，在無菌條件下向消化液中加入血清以中和胰酶，采用離心機進行離心處理；

(8)組織細胞重懸：棄去離心后的上層清液，向離心管中加入細胞生長液并搖晃離心管，使組織細胞脫離離心管管壁，之后加入混合瓶中并振搖混合瓶，使組織細胞成為懸浮液；

(9)組織細胞過濾：將組織細胞重懸液吸入帶有紗布囊式過濾裝置的分裝罐中，細胞懸液通過紗布囊式過濾裝置，使得細胞懸液中的未消化雞胚組織得到過濾截留，之后向分裝罐內補加細胞培養液；

(10)分裝：將分裝罐內的細胞懸浮液分裝至多個細胞工廠；

(11)細胞培養：將細胞工廠放入溫室中靜止培養，得到單層雞胚成纖維細胞。

2.如權利要求1所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(1)中，選取的SPF雞胚為9日齡，溫室內的室溫為38℃。

3.如權利要求2所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(2)中，從溫室內取出雞胚的時間為置入溫室后的第二天，對雞胚的中上部進行碘酒消毒。

4.如權利要求3所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(5)中，將多個獲取的雞胚分裝到多個清洗器內，采用多聯管道將各清洗器頂部三通蓋上的進液口與清洗液儲罐連接，采用多聯管道將各清洗器頂部三通蓋上的抽氣口連接且在該多聯管道上安裝有真空泵，采用多聯管道將各清洗器頂部三通蓋上的出液口與廢液儲罐連接且在該多聯管道上安裝有抽液泵；清洗的次數為三次。

5.如權利要求4所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(6)中，高轉速攪拌和低轉速攪拌在38℃的溫度條件下進行，高速攪拌持續的時間為5min，低轉速攪拌的持續時間為15min；低轉速攪拌后，取消化瓶觀察底部沉淀物，以底部沉淀物中的腦球組織、肝臟、脊椎骨、腿部、翅部骨骼清晰可見且骨骼上沒有肌肉組織作為判定消化雞胚步驟的終點。

6.如權利要求5所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(7)中，加入的血清重量為消化液總重量的3％；離心機的轉速為3000r/min，離心持續時間為10min。

7.如權利要求6所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(9)中，分裝罐的容量為50L，每500個雞胚的組織細胞重懸液向一個分裝罐中注入；分裝罐內的紗布囊式過濾裝置包括18層紗布，完成雞胚的組織細胞重懸液的注入和過濾后，補加細胞培養液到分裝罐的50L刻度線處。

8.如權利要求7所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(10)中，每個分裝罐的出口連接有帶有多個分液頭的分液管，每個分液頭連接至一個細胞工廠的注入口，一次進行多個細胞工廠的細胞懸浮液分裝。

9.如權利要求8所述的規模化制備雞胚成纖維細胞的方法，其特征是：步驟(11)中，細胞工廠的培養溫室的溫度條件為38℃，培養時間為18～24h。