[發明專利]一株產纖維素酶的工程菌Oxa-3及其應用、酶制劑及其制備方法

在審

• 申請號: 202111038765.0
• 申請日: 2021-09-06
• 公開（公告）號: CN113999779A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 甘禮惠;劉健;龍敏南;溫琳蕊
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/56;C12N15/80;C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 廈門加減專利代理事務所(普通合伙) 35234
• 代理人: 李強;楊澤奇

本發明涉及微生物技術領域，提供一株產纖維素酶的工程菌Oxa?3及其應用、酶制劑及其制備方法，其中，一株產纖維素酶的工程菌Oxa?3，其分類命名為里氏木霉，拉丁文學名為Trichoderma reesei，已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢市武漢大學，郵編為430072，保藏編號為CCTCCNO：M2021845，保藏日期為2021年7月8日；該工程菌Oxa?3是由xyr1?hph?ace3表達盒轉化里氏木霉RUT C?30的原生質體，通過酶活力篩選得到，所述xyr1?hph?ace3表達盒的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本發明提供的一株產纖維素酶的工程菌Oxa?3具有高效的產纖維素酶特性，在5L發酵罐中補料發酵6天，發酵液FPA酶活力達到51.23FPU/ml，產酶效率為355.76FPU/h/L且發酵過程簡單，周期短，可應用于纖維素酶工業化生產中，以降低生產成本。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及一株產纖維素酶的工程菌Oxa-3 及其應用、酶制劑及其制備方法。

背景技術

纖維素是自然界中廣泛存在的大分子多糖聚合物，屬于地球上最豐富的可再生生物資源。利用纖維素酶可以將纖維素降解成細菌可發酵利用的糖類如單糖，用以生產生物燃料(如生物乙醇)、生物基精細化工產品和藥品。用來替代或者部分替代化石能源，以減少環境污染。但是纖維素酶的成本是纖維素生物化學轉化工業化應用的主要瓶頸之一。

公開號為CN107012102B，公開日為2020年06月30日，名稱為《一株在可溶性和非可溶性碳源誘導下高產纖維素酶的里氏木霉基因工程菌及構建方法和應用》的專利文件公開的一種在可溶性和非可溶性碳源誘導下高產纖維素酶的里氏木霉基因工程菌，是在里氏木霉RUT C-30中過表達 bgl1-his基因得到的，其分類命名Trichoderma reesei，菌株號SEU-7，已保藏于中國典型微生物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2016492，保藏日期為2016年9月18日，該工程菌SEU-7在可溶性碳源和非可溶性碳源的誘導下，均表現出極高的產纖維素酶的能力。

由于里氏木霉具有完整的纖維素酶系，可以分泌產生纖維素酶，且是人工安全的微生物菌種，成為了重要的纖維素酶工業生產菌株。因此，通過構建工程菌，是提高纖維素酶產量是降低成本的有效方法。

發明內容

為解決上述現有技術中纖維素酶存在生產成本高的問題，本發明以 xyr1-hph-ace3串聯表達盒轉化里氏木霉RUT C-30的原生質體，通過酶活力篩選出具有高效的產纖維素酶能力的工程菌Oxa-3，該工程菌Oxa-3在微晶纖維素為主要碳源的情況下，在5L發酵罐中補料發酵6天，發酵液FPA酶活力達到51.23FPU/ml，產酶效率為355.76FPU/h/L。

本發明提供的工程菌Oxa-3，其分類命名為里氏木霉，拉丁文學名為 Trichodermareesei，已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址為中國武漢市武漢大學，郵編為430072，保藏編號為CCTCC NO：M2021845，保藏日期為 2021年7月8日。

本發明提供的工程菌Oxa-3是由xyr1-hph-ace3表達盒轉化里氏木霉RUT C-30的原生質體得到，所述xyr1-hph-ace3表達盒的基因序列如SEQ ID NO.1 所示。

基于上述方案，在一種實施方式中，所述里氏木霉RUT C-30保藏號為ATCC 56765。

基于上述方案，在一種實施方式中，所述工程菌Oxa-3的構建方法包括如下步驟：

A、制備里氏木霉RUT C-30的原生質體；

B、在里氏木霉RUT C-30的原生質體加入xyr1-hph-ace3片段進行轉化, 并通過含有潮霉素B的培養基篩選出能夠生長的轉化子；

C、將步驟B中篩選得到的轉化子分別進行產酶培養，篩選出高產纖維素酶的轉化子，即工程菌Oxa-3。