[發明專利]一株IPEC-J2細胞ACE2基因敲除穩定株的細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 202111023250.3
• 申請日: 2021-09-01
• 公開（公告）號: CN115725505A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 張源淑;李志強;張崇昊;紀曉霞;曹西月;閆書平;謝娜娜
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/57
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本發明提供一株IPEC?J2細胞ACE2基因敲除穩定株的細胞系及構建方法，包括ACE2基因敲除載體設計、制備、慢病毒包裝、單克隆株篩選及敲除分析等并獲得ACE2基因敲除穩定細胞系。ACE2在抗炎及纖維化、腸道物質吸收轉運及作為SARS?CoV和SARS?CoV?2的功能性受體，調控ACE2對機體健康意義重大。目前未有商品化IPEC?J2細胞ACE2基因敲除穩定株，在一定程度上限制ACE2在豬腸道健康領域的研究。本發明基于CRISPR/Cas9基因編輯技術成功構建出IPEC?J2細胞ACE2基因敲除穩定株，為在動物尤其在豬上的研究提供高價值的生物材料，對豬腸道健康的研究具有重要的生物學意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一株豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)ACE2(Angiotensin converting enzyme 2)基因敲除穩定細胞株的構建、鑒定及方法歸納。

背景技術

血管緊張素轉換酶2(Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000年首次報道的一種單羧肽酶，作為腎素-血管緊張素系統的關鍵調控蛋白，對維持機體全身或局部多種組織器官的功能穩態具有重要意義。近年來的研究發現，ACE2在抑制腸道炎癥、協助腸道物質轉運、維持腸道穩態方面意義重大。我們知道嚴重急性呼吸綜合征(SARS)和新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)通常表現為呼吸系統疾病，但相當一部分患者表現出腹瀉、嘔吐和腹痛等胃腸道癥狀。ACE2作為SARS-CoV和SARS-CoV-2在肺泡上皮和腸上皮的天然受體，它不僅與呼吸道疾病的嚴重程度有關，而且與胃腸道疾病也密切聯系。因而，調控ACE2對SARS冠狀病毒介導的不良癥狀具有積極影響。由上，ACE2多種功能的發現使其成為一個新的疾病標志物和藥物治療靶點引起了國內外學者的廣泛關注。特別是作為冠狀病毒受體方面的研究是一個新的思路，但在動物方面特別是豬上的研究較少。

ACE2廣泛存在于各種動物體內。基于人與動物間存在的種屬差異性，單純將ACE2在人SARS冠狀病毒的作用與畜禽冠狀病毒方面的作用分割開來，可能會造成忽視或淡化ACE2在畜禽冠狀病毒的影響，即ACE2可以作為SARS-CoV和SARS-CoV-2的功能性受體，那么ACE2在動物上是否具有同樣的作用，尤其ACE2是否會介導動物與人冠狀病毒之間的交叉感染等都還不清楚，所以明確人和動物種屬間ACE2基因差異的作用機制或靶點方面的研究勢在必行。

在本發明研究中，以豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)作為研究對象，應用CRISPR/Cas9基因編輯技術實現IPEC-J2細胞中ACE2蛋白功能完全喪失，獲得ACE2基因敲除穩定細胞株，這對于深入研究ACE2作為潛在病毒受體在豬冠狀病毒(如PEDV、TGEV等)感染中發揮的生物學功能及其分子機制，開發以ACE2為冠狀病毒靶向治療藥物奠定基礎。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一株IPEC-J2細胞ACE2基因敲除穩定細胞系。

本發明的第二個目的在于借助其探究ACE2在豬腸道炎癥性病變中的作用及影響。

本發明的第三個目的在于借助其作為研究PEDV等豬冠狀病毒的潛在功能受體的直接生物材料。

本發明的第四個目的在于深化CRISPR/Cas9基因編輯技術在獸醫學研究領域的應用。其具體技術方案為：

一株IPEC-J2細胞ACE2基因敲除穩定株的細胞系及構建方法，包括以下步驟：

S1、通過NCBI查找豬ACE2基因的相關信息并進行分析。根據敲除位點所在區域進行合理選擇，本設計以基因組結構域或結構域上游的外顯子作為敲除位點的設計區域，接著通過在線設計軟件設計敲除位點，并將敲除位標記在基因組序列上。針對上述再進行引物的設計，包括Oligo序列和測序引物的設計。