[發(fā)明專利]一株IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111023250.3
• 申請(qǐng)日: 2021-09-01
• 公開（公告）號(hào): CN115725505A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?jiān)词?/a>;李志強(qiáng);張崇昊;紀(jì)曉霞;曹西月;閆書平;謝娜娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867;C12N15/57
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一株IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、豬ACE2基因敲除載體的設(shè)計(jì)：NCBI查找豬ACE2基因基本信息并進(jìn)行相關(guān)分析，針對(duì)敲除位點(diǎn)所在區(qū)域進(jìn)行合理選擇并進(jìn)行設(shè)計(jì)，根據(jù)敲除位點(diǎn)的位置設(shè)計(jì)檢測(cè)引物；

步驟2、豬ACE2基因敲除載體的制備：原始載體線性化后構(gòu)建敲除載體并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證或PCR檢測(cè)，檢測(cè)無(wú)誤進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中提；

步驟3、嘌呤霉素藥殺濃度篩選及單克隆細(xì)胞生長(zhǎng)能力測(cè)試；

步驟4、慢病毒包裝并進(jìn)行細(xì)胞侵染，期間持續(xù)藥殺2d后進(jìn)行Pool細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量基因組被編輯的細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后通過有限稀釋法分選并挑取單克隆細(xì)胞，其中部分用于基因組檢測(cè)。

步驟5、敲除分析：根據(jù)基因組的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核酸序列分析以及轉(zhuǎn)錄與翻譯預(yù)測(cè)，觀察在各敲除位點(diǎn)的作用下其基因組片段的缺失情況，通過對(duì)CDS翻譯區(qū)域進(jìn)行翻譯預(yù)測(cè)，觀察該蛋白提前終止翻譯情況；

步驟6、免疫印跡檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因突變后蛋白的表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1中，以ACE2基因結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域上游的外顯子作為敲除位點(diǎn)的設(shè)計(jì)區(qū)域，敲除位點(diǎn)的選擇要滿足敲除效率高、脫靶效應(yīng)低、在外顯子和內(nèi)含子交界處，不同位點(diǎn)不重疊的原則，最后將敲除位點(diǎn)標(biāo)記在基因組序列上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟2中，PCR反應(yīng)體系(20uL)：包括8uL ddH₂O，2uL 10×PCR Buffer，5uL Oligo-F/R，于98℃孵育3min后，每20s降低0.5℃，直至25℃左右；取上述雜交產(chǎn)物利用T4DNA連接酶將其與載體在16℃條件下連接1h后進(jìn)行感受態(tài)轉(zhuǎn)化，繼續(xù)37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆測(cè)序驗(yàn)證。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3中，嘌呤霉素濃度梯度設(shè)置為0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/mL，72h后無(wú)細(xì)胞存活的嘌呤霉素濃度即為篩選濃度；通過有限稀釋法將細(xì)胞濃度控制在每100uL細(xì)胞懸液含1-1.5個(gè)細(xì)胞并接種96孔板，觀察細(xì)胞是否存活。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟4中，在載體總量不變的情況下，根據(jù)穿梭載體的大小，調(diào)整穿梭載體與輔助載體的比例，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集培養(yǎng)液后進(jìn)行慢病毒的濃縮與純化便于后續(xù)細(xì)胞侵染。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟5中，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析得出在3個(gè)不同位點(diǎn)作用下，其基因組同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)片段的缺失，蛋白功能喪失。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的IPEC-J2細(xì)胞ACE2基因敲除穩(wěn)定株的細(xì)胞系及構(gòu)建方法，其特征在于，步驟6中，免疫印跡鑒定時(shí)，細(xì)胞蛋白提取步驟將篩選單克隆細(xì)胞的6孔板，PBS洗滌兩次，加入蛋白裂解液，裂解5min，用細(xì)胞刮板將細(xì)胞刮進(jìn)EP管，4℃，12000g/min離心20min，上清即為所需的蛋白溶液，BCA法測(cè)蛋白濃度并統(tǒng)一。