[發明專利]檢測小鵝瘟病毒、鵝副黏病毒、鴨瘟病毒的引物組及其試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 202110965829.5
• 申請日: 2021-08-23
• 公開（公告）號: CN113667774A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 鐘敏;李建軍;鐘云平;郭禮榮;劉瑞平;邱光忠
• 申請（專利權）人: 贛州市畜牧水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明公開了一種檢測小鵝瘟病毒、鵝副黏病毒、鴨瘟病毒的引物組及其試劑盒和檢測方法。所述引物組包括鵝細小病毒檢測引物、鵝副黏病毒檢測引物和鴨瘟病毒檢測引物。所述試劑盒包括上述引物組。本發明建立的多重PCR檢測方法可準確檢測小鵝瘟病毒、鵝副黏病毒、鴨瘟病毒的單一或混合感染，檢測精度高，在病毒鑒別領域具有重要優勢。

背景技術

小鵝瘟（GP）是由鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的一種急性或亞急性的敗血性傳染病,主要侵害4~20日齡的雛鵝，患病鵝以精神萎靡、腹瀉、神經癥狀（頸部扭轉等）、剖檢可見肝臟腫大、滲出性腸炎和腸道栓塞為主要特征。鵝副黏病毒病（GMP）是由禽副黏病毒（Avian paramyxovirus，APMV）引起的一種以頑固性腹瀉、呼吸困難、神經癥狀、消化道黏膜出血壞死為主要特征的一種急性病毒性傳染病，該病可發生于各種年齡的鵝群，日齡越小，發病率和死亡率越高，2周齡內的雛鵝發病率和死亡率可達100%，病鵝在病程后期出現神經癥狀。鴨瘟（DP）也稱為鴨病毒性腸炎，是由鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV）引起的鴨和鵝的急性、傳染性、致死性疾病，DPV是一種泛嗜性病毒，在水禽的腦、脾臟、肝臟等組織中檢出率較高，不同日齡和性別的鴨鵝均可感染，鵝感染鴨瘟的臨診癥狀為腳軟、行動遲緩或臥地不愿行走、食欲減少甚至廢絕、體溫升高、呼吸困難、流眼淚、眼周水腫、泄殖腔充血、水腫、拉黃白色或淡綠色稀糞。

GP、GMP和DP三者的臨床癥狀相似，均會導致鵝出現精神沉郁、拉稀、神經癥狀等，因此，對其病原菌GPV、APMV、DPV做出快速的鑒別檢測，對養殖業的健康發展具有重要意義。對于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學方法，但這些方法存在操作復雜、費時費力、敏感性較差等缺點，特別是當水禽混合感染多種病原時，應用常規方法難以進行早期快速檢測和鑒別診斷。

聚合酶鏈式反應是一種應用聚合酶在體外進行快速擴增特異DNA片段的技術，能從基因水平對病毒進行特異性的檢測，其基本原理是用一對特異的寡核酸鏈做引物，通過與兩條互補模板鏈退火，在DNA聚合酶的作用下進行擴增，經過變性、退火、延伸三步反應的多次循環，使特定目的片段的數量呈指數增加，通過瓊脂糖凝膠電泳方法進行擴增目的片段的鑒定。

一般的PCR是指在同一個反應體系中只需加入一對引物，擴增一段基因，主要用于單個病原的檢測，對于多種病原及不同基因型的檢測需要分別進行多次的PCR反應，十分繁瑣。多重PCR則是在遵循普通PCR原理的基礎上，指在同一擴增反應體系中加入多對引物，經過PCR反應，擴增出多個大小不一的目的基因片段，其反應原理、反應試劑和操作方法與普通PCR相同，但因加入的引物較多，引物之間的相互結合及引物二聚體的形成幾率大大增加，使得該方法的最佳反應條件更加的嚴格。多重PCR能夠在一個PCR體系中應用多對引物分別進行擴增來進行鑒別診斷。多重PCR方法特異性強、敏感性高能夠在短時間內完成多種病原的檢測，鑒別診斷一些臨床上發病癥狀相似和容易混合感染的病原，減少誤診的發生，降低經濟損失。多重PCR具有簡單快捷、節約成本、診斷的周期短、特異性及敏感性強的特點，已被廣泛應用于臨床病原微生物的檢測，特別是用于多種病原混合感染的鑒別診斷中。

目前檢測GPV、APMV、DPV這3種病毒大多采用常規PCR方法，需要做多次檢測，不僅費事費力，還可能造成誤診。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題在于提供一種檢測小鵝瘟病毒、鵝副黏病毒、鴨瘟病毒的引物組及其試劑盒和檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測小鵝瘟病毒、鵝副黏病毒、鴨瘟病毒的多重PCR檢測引物組，所述引物組的核苷酸序列如下：

小鵝瘟病毒檢測引物：

GPV-F989：5’-GACCGTGACTGCAGCATACA-3’，

GPV-R1289：5’-GCTGTCTCGGTTCTCAGTGAG-3’；

鵝副黏病毒檢測引物：

APMV-F33：5’-CGAGATCGTACGGGTAGAAG-3’，