[發明專利]一種枯草芽孢桿菌的MNP標記位點、引物組合物及其應用

在審

• 申請號: 202110963590.8
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113862383A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 彭海;李論;李甜甜;陳利紅;方治偉;周俊飛
• 申請（專利權）人: 江漢大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 張曉冬

本發明公開了一種枯草芽孢桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用，所述MNP標記位點是指在枯草芽孢桿菌基因組上篩選的區分于其他物種且在物種內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域，包括MNP?1～MNP?12的標記位點；所述引物如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.24所示。所述MNP標記位點能特異的鑒定枯草芽孢桿菌并精細的區分不同的亞型；所述引物互不干擾，綜合多重擴增和測序技術，可一次性對多樣本的所有標記位點進行序列分析，具有高通量、多靶點、高靈敏和檢測低頻變異的優勢，可應用于大規模樣本的枯草芽孢桿菌的鑒定和遺傳變異檢測，對枯草芽孢桿菌的科研、退化監測具有重要意義。

技術領域

本發明實施例涉及生物技術領域，特別涉及一種枯草芽孢桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用。

背景技術

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，是芽孢桿菌屬的一種，革蘭氏陽性菌，廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖而得名。枯草芽孢桿菌作為一種安全和極具開發潛力的微生物菌種，現已廣泛應用于工業、農業、醫藥、衛生、食品、畜牧業、水產及科研諸多領域。然而在實際應用過程中，菌種常發生變異、退化、繁殖力下降、抗性效應減弱甚至喪失等現象，特別是在菌種經歷多次傳代以后，這種退化現象更為嚴重，極大地影響了生產或科研工作的正常進行，因此，建立一種快速、準確的枯草芽孢桿菌的變異檢測方法具有重要意義。

經典的枯草芽孢桿菌檢測方法，包括分離培養、PCR技術、全基因組和宏基因組測序等，在時長、操作復雜度、檢測通量、檢測變異的準確性和靈敏度、成本等方面存在一個或多個局限。融合超多重PCR擴增和高通量測序的靶向分子標記檢測技術，可以在低微生物含量的樣本中靶向的富集目標微生物，避免了全基因組和宏基因組測序帶來的大量數據浪費和背景噪音，具有樣本需要量少、診斷結果精確，節約數據量、檢測低頻變異的優勢。

現有的靶向檢測技術檢測的分子標記主要包括SNP和SSR標記。SSR標記是公認的多態性最高的標記，但在微生物中數量少；SNP標記數量巨大，分布密集，是二態性標記，單個SNP標記的多態性不足以捕獲微生物種群中潛在的等位基因多樣性。

因此，開發病原微生物枯草芽孢桿菌的高多態性的新型分子標記及其檢測技術，成為亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明目的是提供一種枯草芽孢桿菌的MNP標記位點、引物組合物、試劑盒及其應用，可以對枯草芽孢桿菌進行定性鑒定和變異檢測，具有多靶標、高通量、高靈敏和精細分型的效果。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

在本發明的第一方面，提供了一種枯草芽孢桿菌的MNP標記位點，所述MNP標記位點為在枯草芽孢桿菌基因組上篩選的物種特異的、且在物種內部具有多個核苷酸多態性的基因組區域，包括AL009126基因組上MNP-1～MNP-12的標記位點。

上述技術方案中，MNP-1～MNP-12的標記位點具體如說明書表1所示，表1中標注的所述MNP標記的起始和終止位置是基于AL009126序列確定的。

在本發明的第二方面，提供了一種用于檢測所述MNP標記位點的多重PCR引物組合物，所述多重PCR引物組合物包括12對引物，所述12對引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24所示。

上述技術方案中，每個MNP標記位點的引物包括上引物和下引物，具體如說明書表1所示。

在本發明的第三方面，提供了一種用于檢測所述枯草芽孢桿菌MNP標記位點的檢測試劑盒，所述試劑盒包括所述的引物組合物。

進一步地，所述試劑盒還包括多重PCR預混液。

在本發明的第四方面，提供了所述的枯草芽孢桿菌的MNP標記位點或者所述的多重PCR引物組合物或者所述的檢測試劑盒在枯草芽孢桿菌檢測中的應用。