[發明專利]一種環狀小非編碼RNA的測序文庫構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110958847.0
• 申請日: 2021-08-20
• 公開（公告）號: CN113684247A
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 周仁龍;肖錫林;張勇剛;劉陳;賀李瓊
• 申請（專利權）人: 深圳市龍華區中心醫院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 陳熙

本發明涉及一種環狀小非編碼RNA的測序文庫構建方法和應用，構建方法包括以下步驟：(1)細胞培養；(2)提取細胞中的總RNA；(3)使用小RNA提取試劑盒提取RNA，去除28S和18S rRNA；(4)通過RAP方法進一步去除5S和5.8S rRNA；(5)去除線性RNA；(6)構建環狀小非編碼RNA的測序文庫。構建出的環狀小非編碼RNA的測序文庫，rRNA殘留少，環狀RNA檢出效率高，測序通量高，數據重復性較好，測序結果驗證成功率高。整個方法操作簡便，耗財耗時少且穩定性高，可重復性和可靠性都非常好。

技術領域

本發明涉及一種環狀小非編碼RNA的測序文庫構建方法和應用，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

人類基因組中,70％左右的序列能夠轉錄為RNA,但多數不能被翻譯成蛋白，這些非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)根據長度分為長非編碼RNA(200nt,long noncodingRNA,lncRNA)和小非編碼RNA(200nt,small non-coding RNA，sncRNA)。

環狀RNA(ciucular RNA,circRNA)是一種區別于傳統線性RNA的RNA家族新成員，其為不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴且以共價鍵形成環形結構的非編碼RNA分子。

基于聯合探針錨定連接測序技術(combinatorial probe-anchor ligation，cPAL)的高通量測序平臺是一種新型的高通量測序平臺，該平臺測序需要的文庫是一種帶有接頭序列的單鏈環狀分子，通過對這種環狀分子進行滾環復制，形成纏繞折疊的線性DNA納米球(DNA nanoball，DNB)?？刂茲L環復制的時間就可以控制DNB的大小，也就是相同的復制時間獲得的DNB大小是一樣的，把這些相同大小的DNB通過重力作用，就可以使之均勻的平鋪在芯片上，這樣測序時獲得的DNB的信號就是均一的，從而提高了測序的準確率。

目前基于cPAL的高通量測序平臺還沒有相應的環狀小非編碼RNA文庫的構建方法，為解決這一問題，本發明開發了一種高效、穩定地構建用于環狀小非編碼RNA高通量的測序文庫的方法，并使這種文庫能用cPAL方法測序的技術。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種環狀小非編碼RNA的測序文庫構建方法和應用，能夠高效、穩定地構建環狀小非編碼RNA的測序文庫，該方法rRNA殘留比例低，數據重復性較好，且該方法尤其適用于聯合探針錨定連接測序技術。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種環狀小非編碼RNA的測序文庫構建方法，包括以下步驟：(1)細胞培養；(2)提取細胞中的總RNA；(3)使用小RNA提取試劑盒提取RNA，去除28S和18S rRNA；(4)通過RAP方法進一步去除5S和5.8S rRNA；(5)去除線性RNA；(6)構建環狀小非編碼RNA的測序文庫。

本發明的有益效果是：采用本發明的方法構建的環狀小非編碼RNA的測序文庫，rRNA殘留少，環狀RNA檢出效率高，測序通量高，數據重復性較好，測序結果驗證成功率高。整個方法操作簡便，耗財耗時少且穩定性高，可重復性和可靠性都非常好。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述步驟(1)中，細胞在37℃、5％v/v CO₂的細胞培養箱中培養，培養基為DMEM加10％v/v胎牛血清和1％v/v雙抗，當細胞生長密度達到65％-85％時，收集細胞。

采用上述進一步方案的有益效果是先進行細胞的培養，可以擴大總RNA的量，前期的細胞培養很有必要，能夠保證總RNA的量足夠，而且提前富集RNA也有利于后續各個步驟對于不同RNA的分離。

進一步，所述細胞為體細胞、生殖細胞、胚胎細胞、干細胞、腫瘤細胞中的一種。