[發(fā)明專利]一種通過迭代飽和突變提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110952917.1
• 申請(qǐng)日: 2021-08-19
• 公開（公告）號(hào): CN113528487B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉松;李陽陽;陳堅(jiān);堵國成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開了一種通過迭代飽和突變提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于基因工程領(lǐng)域領(lǐng)域。本發(fā)明通過經(jīng)過5輪篩選得到突變體A124P/A130N/T121V/T129L/I126V，最佳反應(yīng)溫度為60℃，較xynA上升10℃。野生型酶xynA的半衰期tsubgt;1/2/subgt;supgt;50℃/supgt;為18min，突變體在50℃下孵育1200min，酶活沒有下降趨勢(shì)。在55℃、60℃和下70℃孵育5min，仍然能保持76.8％、68.4％和35.5％的酶活力，且在pH?2.0?9.0間很穩(wěn)定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過迭代飽和突變提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，屬于基因工程領(lǐng)域領(lǐng)域。

背景技術(shù)

木聚糖酶酶系包括β-1,4-D-木聚糖酶(EC?3.2.1.8)、β-D-1,4木糖苷酶(EC3.2.1.37)、α-L-阿拉伯糖苷酶(EC?3.2.1.55)和α-L-葡萄糖醛酸苷酶(EC?3.2.1.139)，其中，β-1,4-D-木聚糖酶是最關(guān)鍵的酶，它以內(nèi)切的方式將β-1,4-糖苷鍵斷裂。該酶在食品、醫(yī)藥、飼料和新能源等方面應(yīng)用廣泛，但由于其熱穩(wěn)定性較差，在生產(chǎn)過程中限制了其使用。其中，11家族木聚糖酶由于其pH耐受性和底物特異性具有較大潛力，但熱穩(wěn)定性差是亟需解決的問題。

隨著蛋白質(zhì)工程技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，已有許多學(xué)者運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)成功對(duì)蛋白的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了改造。如專利CN104911163B中，發(fā)明人構(gòu)建了5個(gè)突變體，最適溫度提高了2-17℃，65-80℃范圍內(nèi)的半衰期提高了2-16倍。李治宏將11家族木聚糖酶loop區(qū)的T152突變?yōu)镻he，在70℃條件下活性比野生型提高27％。但目前的并沒有熱穩(wěn)定性提高的同時(shí)保持pH穩(wěn)定性的木聚糖酶。

發(fā)明內(nèi)容

[技術(shù)問題]

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高且保持pH穩(wěn)定性的木聚糖酶。

[技術(shù)方案]

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種木聚糖酶突變體，所述木聚糖酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明還提供了編碼上述木聚糖酶突變體的基因。

本發(fā)明還提供了攜帶上述基因的載體。

在一種實(shí)施方式中，所述載體以pET-22b(+)為表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了表達(dá)上述基因或上述載體的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種重組菌，所述重組菌表達(dá)上述木聚糖酶突變體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌以pET-22b(+)為表達(dá)載體。

在一種實(shí)施方式中，所述重組菌以大腸桿菌為宿主細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌包括E.coli?JM109和E.coli?BL21。

本發(fā)明還提供了一種提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性的方法，所述方法為將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的木聚糖酶的第121位的蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第124位的丙氨酸突變?yōu)楦彼幔?26位的異亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第129位的蘇氨酸突變?yōu)榱涟彼岷?或第130位的丙氨酸突變?yōu)樘於０贰?/p>

本發(fā)明還提供了一種用于降解木聚糖的組合物，所述組合物含有上述木聚糖酶突變體作為活性成分，以所述組合物的總重量為基準(zhǔn)，所述木聚糖酶的含量為10-90重量％。

本發(fā)明還提供了上述木聚糖酶突變體，或上述基因，或上述載體，或上述重組菌，或上述組合物在降解木聚糖中的應(yīng)用。

[有益效果]