[發(fā)明專利]高效人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多譜系小腸類器官方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110940521.5
• 申請(qǐng)日: 2021-08-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113388572B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛嘯虎;吳迪;曹寧;徐迎;田應(yīng)洲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天九再生醫(yī)學(xué)（天津）科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 天津合正知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12229
• 代理人: 馬云云

本發(fā)明提供了一種高效人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多譜系小腸類器官方法，該方法包括如下步驟：S1、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化形成內(nèi)胚層樣細(xì)胞；首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再用含有GDF 8和B27的第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后再更換為含有激活素A和dFBS的第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到；S2、誘導(dǎo)內(nèi)胚層樣細(xì)胞分化為中?后腸球；S3、誘導(dǎo)中?后腸球分化為小腸類器官。該方法相比于目前廣泛流行幾種方法，可大幅提高小腸類器官產(chǎn)生效率，節(jié)約成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物學(xué)及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種高效人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多譜系小腸類器官方法。

背景技術(shù)

小腸在營(yíng)養(yǎng)吸收、病原屏障、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝等方面發(fā)揮重要作用。在口服藥研發(fā)的臨床前研究階段，需使用人小腸組織或細(xì)胞對(duì)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。然而，供體的不足致使這些原代資源難以獲取；而目前被廣泛使用的人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2存在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與正常組織表達(dá)差異過(guò)大、藥物代謝酶表達(dá)量低等問(wèn)題。

隨著近年再生醫(yī)學(xué)與組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，由人多能干細(xì)胞（humanpluripotent stem cells，hPSC）于體外誘導(dǎo)分化為3D小腸類器官的技術(shù)為解決這一難題帶來(lái)了希望：一方面，相比于單層的Caco-2細(xì)胞，3D類器官包含更生理相關(guān)的結(jié)構(gòu)與譜系，更貼近體內(nèi)；另一方面，由于hPSC的自我更新能力，可源源不斷地進(jìn)行類器官分化用以供給。

目前，自hPSC向小腸類器官誘導(dǎo)分化的方法，均沿用或改良于Jason R. Spence等人最初創(chuàng)立的分化系統(tǒng)（Directed differentiation of human pluripotent stem cellsinto intestinal tissue in vitro[J]. Nature, 2011, 470(7332): 105-109.）。然而，此系統(tǒng)分化效率低、成本高、難以實(shí)現(xiàn)大范圍的應(yīng)用（A refined culture system forhuman induced pluripotent stem cell-derived intestinal epithelial organoids[J]. Stem cell reports, 2018, 10(1): 314-328..）。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種高效人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多譜系小腸類器官方法，相比于目前廣泛流行幾種方法Generation of small intestinal organoidsfor experimental intestinal physiology.Methods in Cell Biology 159 (2020):143-174.; Differentiation of human intestinal organoids with endogenousvascular endothelial cells. Developmental Cell, 54(4), 516-528; Generation ofintestinal organoids derived from human pluripotent stem cells for drugtesting. Scientific reports, 2020, 10(1): 1-11.），可大幅提高小腸類器官產(chǎn)生效率，節(jié)約成本。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種高效人多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為多譜系小腸類器官方法，該方法包括如下步驟：

S1、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化形成內(nèi)胚層樣細(xì)胞；

首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再用含有GDF 8和B27的第二誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后再更換為含有激活素A和dFBS的第三誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)得到；

S2、誘導(dǎo)內(nèi)胚層樣細(xì)胞分化為中-后腸球；