[發明專利]高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法

有效

• 申請號: 202110940521.5
• 申請日: 2021-08-17
• 公開（公告）號: CN113388572B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 葛嘯虎;吳迪;曹寧;徐迎;田應洲
• 申請（專利權）人: 天九再生醫學（天津）科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 馬云云

1.一種高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

S1、誘導人多能干細胞分化形成內胚層樣細胞；

首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一誘導培養基中培養，再用含有GDF 8和B27的第二誘導培養基培養，然后再更換為含有激活素A和dFBS的第三誘導培養基繼續培養得到；

S2、誘導內胚層樣細胞分化為中-后腸球；

S3、誘導中-后腸球分化為小腸類器官；

其中，B27為B27- insulin；

在第一誘導培養基中的培養時間為24h，在第二誘導培養基中的培養時間為24h，在第三誘導培養基中的培養時間為24h；

所述第一誘導培養基含有RPMI-1640培養基作為基礎培養基，并添加100ng/mlrhGDF8、1-5μM CHIR99021、0.5-2% B27- insulin、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA；

所述第二誘導培養基含有RPMI-1640培養基作為基礎培養基，并添加100ng/mlrhGDF8、0.5-2% B27- insulin、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA ；

所述第三誘導培養基含有RPMI-1640培養基作為基礎培養基，并添加50-300ng/mlrhActA、0.5-2% dFBS、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA 。

2.根據權利要求1所述的高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法，其特征在于：所述S2包括如下步驟：

將S1步驟中得到的內胚層樣細胞在第四誘導培養基中培養4-8天，其中，第四誘導培養基含有RPMI-1640培養基作為基礎培養基，并添加1-5μM CHIR99021、100-1000ng/ml FGF4、0.5-3% dFBS、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA。

3.根據權利要求2所述的高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法，其特征在于：所述S2培養條件為37℃、5% CO₂，每24h更換新培養基。

4.根據權利要求1所述的高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法，其特征在于：所述S3包括如下步驟：

收集中-后腸球，加入腸分化培養基中，并繼續培養20-30天，其中，腸分化培養基含有Advanced DMEM/F12培養基作為基礎培養基，并添加50-300ng/ml rhEGF、50-200ng/mlrhNOG、300-1000ng/ml rhRSPO、0.5-1% B27、0.5-1% N2、3-15mM HEPES、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA。

5.根據權利要求4所述的高效人多能干細胞體外誘導分化為多譜系小腸類器官方法，其特征在于：所述S3培養條件為37℃、5% CO₂，每72h更換新培養基。