[發明專利]一種全血糖化血紅蛋白含量液相色譜串聯質譜定量檢測方法

有效

• 申請號: 202110921727.3
• 申請日: 2021-08-12
• 公開（公告）號: CN113466384B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 呂小波;夏躍蓮;黃和飛;李佳興;谷葉
• 申請（專利權）人: 昆明和合醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 康珉

1.一種全血糖化血紅蛋白含量液相色譜串聯質譜定量檢測方法，其特征在于，將待測全血樣本制備成溶血液，用重組羧肽酶B將溶血液酶解，然后用HPLC-MS/MS進行分離定量分析，并以HbA₀二肽標準品和HbA_1c二肽標準品的混合物作為校準品，用HPLC-MS/MS進行分離定量分析，繪制標準曲線，用待測全血樣本中的HbA_1c二肽和HbA₀二肽的峰面積值，通過標準曲線計算得出待測全血樣本中的HbA_1c和HbA₀二肽的濃度，再用以下計算公式計算得到待測全血樣本中的HbA_1c的含量，單位為質量百分數，計算公式為：待測全血樣本中的HbA_1c的含量=HbA_1c二肽/(?HbA_1c二肽+?HbA₀二肽)?×100%，公式中，HbA_1c二肽表示待測全血樣本中HbA_1c二肽的濃度，HbA₀二肽表示待測全血樣本中HbA₀二肽的濃度；

所述HPLC-MS/MS分析中采用以下色譜條件和質譜條件：

色譜條件：色譜柱：?ZORBAX?SB-CN，2.1?mm×150mm，5μm，柱溫：35℃，流動相A：0.2%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，進樣量：1μL，流速：0.35mL/min，流動相比例：95%B,?5%A等度洗脫，洗脫時間為4.5min；

質譜條件：離子源模式為ESI源正離子模式，掃描方式：RMR，霧化氣流量：3?L/min；加熱氣流量：10?L/min；接口溫度：350℃；DL溫度：150℃；加熱塊溫度：350℃；干燥氣流量：10?L/min。

2.根據權利要求1所述的全血糖化血紅蛋白含量液相色譜串聯質譜定量檢測方法，其特征在于，所述待測全血樣本制備成溶血液過程包括：用移液槍移取100?μL全血樣本于1.5mL塑料離心管中，于5600?r/min?8℃離心10?min后棄血漿，取出棄血漿后的血細胞10?μL于新的1.5?mL塑料離心管中，加入10?μL純水后1500?r/min勻30s，再加入200μL儲備緩沖溶液后于1500?r/min旋混勻1?min即制成溶血液；

所述儲備緩沖溶液按如下方法配制而得：移液器取1mol/Lβ嗎啉乙磺酸溶液，?0.5mol/L碳酸氫鈉溶液，?1mol/L?Na₂-EDTA溶液，加純水定容至100?mL混勻，使β嗎啉乙磺酸終濃度為50mmol/L、NaHCO₃終濃度為25mmol/L、Na₂-EDTA終濃度1mmol/L，_PH值為6.2即為儲備緩沖溶液。

3.?根據權利要求1所述的全血糖化血紅蛋白含量液相色譜串聯質譜定量檢測方法，其特征在于，所述用重組羧肽酶B將溶血液酶解過程包括：將盛有溶血液的塑料離心管于12000?r/min高速離心10?min后，取出5?μL上層液于另一支新的1.5mL塑料離心管中，加入15?μL濃度為?200μg/mL的重組羧肽酶B溶液，加入200μL消化緩沖溶液于37℃水浴2h，再于-20℃凍存10min后取100?μL?溶液進行HPLC-MS/MS分離定量分析，進樣量為1μL；

所述消化緩沖溶液按如下方法配制而得：

精密稱量碳酸氫鈉1.68g，置于15mL離心管中，加入10mL純水溶解，振蕩混勻，得到2mol/L碳酸氫鈉溶液，移液器取2?mol/L碳酸氫鈉溶液2.5?mL加純水定容至100mL，混勻，測量其_PH，用乙酸調節其_PH值到8.0即為消化緩沖溶液，4℃保存。