[發(fā)明專利]一種超聲誘變的鼠傷寒沙門氏菌hisD基因InDel分子標(biāo)記及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110909368.X
• 申請日: 2021-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN113736895A
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 阮思煜;李云亮;馬海樂;紀(jì)耀勇;周安奇;謝鵬飛;趙博博;劉曉霜;徐雅宣;吳燕伶
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/02;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種超聲誘變的鼠傷寒沙門氏菌hisD基因InDel分子標(biāo)記及應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和超聲誘變技術(shù)領(lǐng)域；在本發(fā)明中，通過對鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行超聲誘變，測序發(fā)現(xiàn)所有InDel突變均發(fā)生在hisD基因一個(gè)核心突變區(qū)域，因此將該核心突變區(qū)域作為InDel分子標(biāo)記，并將其用于分析基因回復(fù)突變插入或缺失的判定，同時(shí)該InDel分子標(biāo)記也可以應(yīng)用于分析hisD基因序列與其所編碼蛋白質(zhì)功能的關(guān)系。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和超聲誘變技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超聲誘變的鼠傷寒沙門氏菌hisD基因InDel分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)

微生物在解決人類的糧食、能源、健康、資源和環(huán)境保護(hù)等問題中發(fā)揮著越來越重要且不可替代的獨(dú)特作用，也為人類帶來了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。為了獲得高產(chǎn)、低耗、優(yōu)質(zhì)的菌種，人們常常通過物理、化學(xué)或生物因子等因素進(jìn)行誘變育種。其中物理因素誘變由于安全性高、操作方便、設(shè)備簡單和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)得到普遍關(guān)注。如通過紫外線輻射改變活性污泥的微生物組成結(jié)構(gòu)，優(yōu)化目標(biāo)菌的生長環(huán)境，增強(qiáng)活性污泥的生化降解能力；通過離子注入誘變獲得有益突變多且后代穩(wěn)定遺傳的突變體；通過飛秒激光技術(shù)，結(jié)合物理過程和生物化學(xué)反應(yīng)過程，全面系統(tǒng)地研究誘變機(jī)理。其中超聲場誘變因方向性好、穿透能力強(qiáng)、安全性高以及便于控制而受到越來越多的關(guān)注。

超聲場誘變研究主要側(cè)重于對生物效應(yīng)的研究，而對其誘變機(jī)理的研究尚少，不利于超聲誘變技術(shù)和超聲設(shè)備的進(jìn)一步發(fā)展。誘變機(jī)理的研究依賴于對基因變異的精準(zhǔn)分析，超聲等物理場帶有高能效應(yīng)會(huì)引起DNA鏈的變化，其變異主要分為三大類：1. 單核苷酸變異，（single nucleotide polymorphism，SNP）；2. 小的插入或缺失（Insertion andDeletion，InDel），指的是在基因組的某個(gè)位置上所發(fā)生的小片段序列的插入或者刪除，其長度通常在50 bp以下；3. 大的結(jié)構(gòu)性變異，這種類型比較多，包括長度在50 bp以上的長片段序列的插入或者刪除、染色體倒位，染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位，拷貝數(shù)變異，以及一些形式更為復(fù)雜的變異。第2和第3類變異通常也被稱為基因組結(jié)構(gòu)性變異（Structural variation，SV）。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)SV對基因組的影響比起SNP來說還要大，基因組上的SV比起SNP而言，似乎更能用于解釋物種群體多樣性的特征，稀有且相同的一些結(jié)構(gòu)性變異往往和疾病的發(fā)生相關(guān)聯(lián)甚至還是其致病的誘因。

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種非適應(yīng)性或泛嗜性的沙門氏菌，宿主范圍廣，是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，也是微生物遺傳學(xué)發(fā)展的一種非常重要的細(xì)菌，常被改造為弱毒疫苗活載體，廣泛應(yīng)用于多種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等免疫研究，并取得了良好的效果。組氨酸營養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)）檢測化學(xué)物質(zhì)的潛在致癌性為觀察基因突變的好方法，廣泛地用于篩選化學(xué)物質(zhì)或者物理場的遺傳毒性和潛在致癌性。有資料報(bào)道Ames試驗(yàn)對大鼠致癌物和恒河猴致癌物的檢出率分別為69.0%和87.5%，也是化合物QSAR構(gòu)效關(guān)系建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫的重要基礎(chǔ)。

參與組氨酸合成的基因主要有hisA、hisB、hisC、hisD、hisE、hisF、hisG、hisH和hisI等9個(gè)基因，這些基因的突變可能會(huì)引起組氨酸合成能力的喪失，而某些突變的基因可以通過回復(fù)突變恢復(fù)正常的基因功能，這是Ames試驗(yàn)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。根據(jù)基因回復(fù)突變類型的不同，已發(fā)展出多種用于檢測突變類型的菌株，其中對于點(diǎn)突變或者寡核苷酸鏈（≤ 4 bp）突變，發(fā)展出用于檢測組氨酸靶基因中鳥嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點(diǎn)堿基置換或移碼突變的4種組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA1535、TA1537/TA97/TA97a、TA98和TA100），以及用于檢測組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點(diǎn)堿基置換或移碼突變的鼠傷寒沙門氏菌（TA102）；對于DNA大規(guī)模受損引起的易錯(cuò)修復(fù)突變，發(fā)展出基于SOS修復(fù)的Umu試驗(yàn)菌株（TA1535）。目前在鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變檢測體系中尚無針對大于4bp寡核苷酸鏈插入或缺失的檢測方法，該方法對超聲等物理場誘變方法的優(yōu)化和評價(jià)都有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容