[發(fā)明專利]減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110907859.0
• 申請日: 2021-08-09
• 公開（公告）號: CN113461804A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 齊智;常貝貝;高磊;艾云鵬;柏凱
• 申請（專利權(quán)）人: 山東健通生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/14
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 劉靜榮

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法。本發(fā)明的減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法，包括向發(fā)酵液中加入辛酸鈉和/或半胱氨酸的步驟。本發(fā)明在重組人血白蛋白的發(fā)酵過程中加入半胱氨酸和辛酸鈉，可以有效降低發(fā)酵液中色素水平，有利于下游的純化工藝達(dá)到醫(yī)藥級基因重組人血白蛋白的水平，同時，還可以穩(wěn)定目的蛋白質(zhì)在發(fā)酵液的半衰期，保護(hù)白蛋白免受蛋白酶的降解。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法。

背景技術(shù)

人血白蛋白HSA是一種單鏈蛋白質(zhì)，由585個氨基酸殘基組成，N端是天門冬氨酸，C端是亮氨酸。mRNA由2078個核苷酸組成。成熟的HSA分子的氨基酸序列中共有17對二硫鍵，一個半胱氨酸位點(diǎn)，一個色氨酸位點(diǎn)，空間結(jié)構(gòu)類似橢圓形。

人血白蛋白HSA(Human Serum Albumin)作為人體血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，起著維持血漿滲透壓、運(yùn)輸營養(yǎng)和其他重要作用。臨床上用于休克、燒傷、創(chuàng)傷、低蛋白血癥或急性血容量減少癥的治療，其使用劑量一般高達(dá)10g，是其他生物因子類產(chǎn)品的幾萬至百萬倍，占國際市場血液制劑銷售額的首位。

現(xiàn)有技術(shù)利用微生物體重組表達(dá)人血白蛋白的，但是該方法獲得的重組白蛋白中外源性物質(zhì)較多，而且由于人血白蛋白注射劑量較大，微量的抗原性物質(zhì)都可能引起過敏反應(yīng)，甚至危害患者的生命安全，因此對基因工程重組人血白蛋白的純度要求更高，純化技術(shù)難度更大。

甲醇酵母發(fā)酵過程中往往產(chǎn)生大量的色素，對下游純化非常不利。目前，限制白蛋白達(dá)到醫(yī)藥級水平的主要因素有兩個：一個是色素的去除；另一個是HCP的去除。現(xiàn)有重組人血白蛋白生產(chǎn)工藝中，均為發(fā)酵完成后，在純化工藝增加去除色素步驟，工藝繁瑣、且純化效果不理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法。

根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式的減少重組人血白蛋白發(fā)酵過程中色素的方法，所述方法包括向發(fā)酵液中加入辛酸鈉和/或半胱氨酸的步驟。

基因重組人血白蛋白發(fā)酵過程中，加入辛酸鈉、半胱氨酸或者辛酸鈉和半胱氨酸的組合物均可起到降低發(fā)酵液色素濃度的效果。

其中，辛酸鈉的用量為1～16μM，半胱氨酸的用量為1～16μM；具體的，加入辛酸鈉的量為1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的需要，辛酸鈉的量可以調(diào)整為非整數(shù)用量，如1.5μM、2.5μM、3.5μM、4.5μM、5.5μM、6.5μM、7.5μM、8.5μM、9.5μM、10.5μM、11.5μM、12.5μM、13.5μM、14.5μM、15.5μM；

同樣的，加入半胱氨酸的量為1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的需要，半胱氨酸的量可以調(diào)整為非整數(shù)用量，如1.5μM、2.5μM、3.5μM、4.5μM、5.5μM、6.5μM、7.5μM、8.5μM、9.5μM、10.5μM、11.5μM、12.5μM、13.5μM、14.5μM、15.5μM。

優(yōu)選的，辛酸鈉的用量為1～3μM，半胱氨酸的用量為1～3μM；當(dāng)加入辛酸鈉2μM、半胱氨酸2μM時，發(fā)酵液中色素的去除效果最為顯著。

發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)，除了辛酸鈉和半胱氨酸外，谷胱甘肽、DTT、巰基乙醇、乙酰色氨酸等試劑，也具有發(fā)酵過程中降低色素濃度的作用，上述試劑的用量為1～16μM。

加入辛酸鈉和/或半胱氨酸的時機(jī)為，甲醇誘導(dǎo)開始同時、甲醇誘導(dǎo)開始前，或者甲醇誘導(dǎo)過程中，其中，以甲醇誘導(dǎo)開始的同時加入酸鈉和/或半胱氨酸，色素降低的效果最為明顯。