[發(fā)明專利]一株分泌抗二甲戊靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110905029.4
• 申請日: 2021-08-08
• 公開（公告）號: CN113637081B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 胥傳來;劉杰;匡華;劉麗強;宋珊珊;胡擁明;徐麗廣;胥欣欣;吳愛紅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;C07C229/60;G01N33/53;G01N33/577
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

一株分泌抗二甲戊靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發(fā)明提供了一株分泌抗二甲戊靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏編號CGMCC?No.20791。本發(fā)明將二甲戊靈完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化，通過頸背部皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。將高效價，低ICsubgt;50/subgt;小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，采用選擇培養(yǎng)基，篩選出兩種細胞融合后的雜交細胞；再經(jīng)過間接競爭酶聯(lián)免疫法篩選細胞并三次亞克隆，最終得到一株單克隆抗體雜交瘤細胞株ACE。雜交瘤細胞株ACE分泌產(chǎn)生的單克隆抗體對二甲戊靈具有較好親和力和較高靈敏度，為動物源性食品中二甲戊靈的檢測提供有力的檢測方法及手段。

技術領域

本發(fā)明涉及一株分泌抗二甲戊靈單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

二甲戊靈屬二硝基苯胺類除草劑，化學名稱為N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲基苯胺，又名二甲戊樂靈，施田補，除芽通等。二甲戊靈是一種高效，低毒的除草劑，作用機制是通過二甲戊靈進入植物體內與微管蛋白結合,抑制植物細胞的分裂和伸長。近年來被廣泛應用于玉米、馬鈴薯、水稻、大豆、煙草、蔬菜等多種作物的除草。它的廣泛使用導致在土壤、地下水、地表水和空氣中被檢測出來,對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生了重大的危害。

有關二甲戊靈殘留在果蔬中的檢測方法，國內外已有少量報道，主要是用高效液相色譜-熒光檢測器檢測法及液相色譜-串聯(lián)質譜法。提取的方法也各有不同，有液-液萃取、液-固萃取等。儀器檢測方法可進行定量分析并具有較低的檢測限，但是通常需要昂貴的儀器和復雜的操作，前處理及檢測時間長，嚴重制約了這些檢測方法的推廣。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對技術人員相對要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查。

CN10961147A公開了一種檢測二甲戊靈的試紙條及其制備方法和應用，其同樣采用了免疫分析方法進行檢測，其采用的二甲戊靈半抗原為由N-(1-乙基基)-3,4-二甲基苯胺與4-溴丁酸乙酯反應生成烴基化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，再與濃硝酸反應生成硝基烴化N-(1-乙基丙基)-3,4-二甲基苯胺，然后與氫氧化鉀反應得到；其半抗原是在二甲戊靈的中部的亞氨基的位點衍生出羧基，而本發(fā)明直接使用二甲戊靈的結構類似物4-[(1-乙基丙基)氨基]-2-甲基-3,5-二硝基苯甲酸作為半抗原，該類似物與二甲戊靈結構極其相似，在完全保留二甲戊靈化學結構的基礎上，在二甲戊靈的邊側增加了一處羧基用于結合蛋白從而制備免疫原。相比較兩個半抗原結構，本發(fā)明中的半抗原更大程度上保留了二甲戊靈的原有結構，且邊側的羧基偶聯(lián)蛋白后，二甲戊靈的特異識別位點更容易被暴露，有利于產(chǎn)生針對二甲戊靈靈敏度更高的抗體。且本發(fā)明的半抗原可直接從現(xiàn)有化合物中獲得，無需繁瑣的化學合成步驟，節(jié)省成本。

CN109324182?A公開了一種檢測二甲戊靈的熒光微球免疫層析試紙條及其制備方法和應用，其采用的二甲戊靈半抗原是由3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛與3-肼基丙酸反應得到，與本發(fā)明相比，其結構是在二甲戊靈類似物的基礎上，衍生出用于結合蛋白的羧基。但最終的半抗原結構與二甲戊靈相比，增加了雙鍵、亞氨基等不必要的結構，而半抗原的設計原則是盡可能在最大程度上保留原有結構，才能獲得高靈敏度的抗體。因此，本發(fā)明的半抗原與之相比，具有和二甲戊靈更好的一致性。因此本發(fā)明的半抗原更有利于產(chǎn)生高靈敏度的抗體。