[發(fā)明專(zhuān)利]基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法及在突變檢測(cè)中的應(yīng)用在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202110882685.7 | 申請(qǐng)日： | 2021-08-02 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN113462759A | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-10-01 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王偉偉;劉萌;劉星宇;張利利;田埂 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 元碼基因科技（北京）股份有限公司 |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/6858 | 分類(lèi)號(hào)： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 北京北匯律師事務(wù)所 11711 | 代理人： | 高元吉 |
| 地址： | 100102 北京市朝陽(yáng)*** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基于 多重 擴(kuò)增 探針 捕獲 組合 dna 序列 富集 方法 突變 檢測(cè) 中的 應(yīng)用 | ||
1.一種基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)提供來(lái)自生物樣本的單鏈狀態(tài)的DNA片段，在所述DNA片段的末端連接一連接臂，所述連接臂設(shè)計(jì)為能夠通過(guò)接頭的互補(bǔ)臂與接頭連接；
(2)通過(guò)局部雙鏈互補(bǔ)配對(duì)和連接反應(yīng)使所述DNA片段的末端與接頭連接，局部雙鏈結(jié)構(gòu)有助于提高單鏈連接效率；
(3)加熱使所述接頭與所述DNA片段分離，從而形成單鏈狀態(tài)的第一擴(kuò)增模板；
(4)利用所述第一擴(kuò)增模板進(jìn)行多重PCR，得到第二擴(kuò)增模板，其中，所述多重PCR的引物包括特異性引物和第一INDEX引物；
(5)利用所述第二擴(kuò)增模板進(jìn)行通用PCR，得到雜交捕獲用片段，所述通用PCR的引物包括通用引物和第二INDEX引物；
(6)使探針和所述雜交捕獲用片段進(jìn)行接觸，從而捕獲目標(biāo)片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括進(jìn)行捕獲后PCR，從而得到測(cè)序文庫(kù)的步驟，其中測(cè)序文庫(kù)中的片段長(zhǎng)度為150-500bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述第一INDEX引物和所述第二INDEX引物為相同引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述特異性引物包含第一通用引物結(jié)合序列和能夠與目標(biāo)序列一側(cè)的序列特異性互補(bǔ)結(jié)合的結(jié)合序列，所述第一INDEX引物或所述第二INDEX引物各自分別包含第二通用引物結(jié)合序列和INDEX序列，且第一INDEX引物和第二INDEX引物各自的至少一部分與所述接頭的序列的至少一部分相同，從而能夠使INDEX引物能夠與所述DNA片段形成雙鏈結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述第一通用引物結(jié)合序列和所述第二通用引物結(jié)合序列為相同的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述生物樣本為血液，包括全血、血漿、血清；所述DNA片段為cfDNA或ctDNA或人工片段化DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述接頭包含條形碼序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括對(duì)測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多重?cái)U(kuò)增和探針捕獲的組合對(duì)單鏈DNA序列富集測(cè)序的方法，其特征在于，所述連接臂為poly C，C的個(gè)數(shù)為1-10；所述互補(bǔ)臂為poly G，G的個(gè)數(shù)為1-10。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法在單鏈DNA突變檢測(cè)中的應(yīng)用。
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