[發明專利]一種N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶的提取方法

在審

• 申請號: 202110873349.6
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113373134A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 丁春華;章文劼
• 申請（專利權）人: 江蘇海飛生物科技有限公司;拜啟私人有限公司
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種N?乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶的提取方法，屬于生物工程技術領域。本發明以含有N?乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶的發酵液為原料，經過絮凝離心或陶瓷微濾膜收集微生物濃懸液，同時去除發酵過程中殘留營養物成分；再通過高壓均質使細胞壁破裂，釋放出細胞內容物和目標酶，最后通過陶瓷微濾膜或超濾膜透析出富含有N?乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶的溶液，同時截留去除細胞碎片成分。本發明在提升酶的提取回收率的同時，提取過程中物耗和廢水產生量較少，實現了良好的經濟效益和環保安全的效果。

技術領域

本發明涉及一種N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶的提取方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

D-葡萄糖胺在人體內具有重要的生理意義，應用于醫藥、食品和化妝品等領域。甲殼素廣泛分布于蝦殼、蟹殼等生物原料中，但生產過程需要使用強酸和強堿，易造成嚴重的環境污染。利用基因工程技術可以構建生產N-乙酰氨基葡萄糖的重組微生物，可以實現N-乙酰氨基葡萄糖的大規模生產，但距離D-葡萄糖胺仍有一步之遙，需要N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶催化水解后才能得到。

N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶(EC 3.5.1.33)是一種重要的脫乙酰酶，分子量為30～60kDa，一些酶復合體的分子量在160～200kDa之間。催化的生物反應式為：N-乙酰-D-葡萄糖胺+H₂O＝D-葡萄糖胺+乙酸。Roseman于1957年首次發現該酶催化和參與D-葡萄糖胺的代謝過程。同族中相近功能的脫乙酰酶還包括甲殼糖脫乙酰酶(EC 3.5.1.41)，二乙酰殼二糖脫乙酰酶(EC 3.5.1.105)和N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脫乙酰酶(EC 3.5.1.25)。目前已發現的存在N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因的微生物主要有大腸桿菌、乳酸乳球菌、柯達卡熱球菌、堀越熱球菌等(J.Biol.Chem.2004,279,30021-30027)。通過重組大腸桿菌、重組枯草芽孢桿菌等微生物經過好氧發酵可實現高效表達和生產得到。提取N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶是生產D-葡萄糖胺的關鍵步驟之一。

1993年美國專利(US 5219749)公開了一種純化甲殼糖脫乙酰酶的方法，利用硫酸銨沉淀法富集魯氏毛霉發酵液中的甲殼糖脫乙酰酶，再依次經過疏水色譜、強陰離子交換色譜和強陽離子交換色譜三個單元，最終得到較純的甲殼糖脫乙酰酶。

2002年希臘克里特大學Bouriotis等從釀酒酵母中提取出甲殼糖脫乙酰酶，其提取步驟主要包括：以硫酸銨沉淀法富集粗酶后，加入到苯基–SepharoseHiLoad(疏水)色譜柱，梯度洗脫后再載入到Mono S陽離子交換色譜柱上分離，最終得到較純的甲殼糖脫乙酰酶，回收率24.5％。

2006年武漢大學蔡軍利用短柄帚霉好氧發酵獲得甲殼糖脫乙酰酶，利用硫酸銨沉淀法富粗酶，再依次經過Sephadex G-25和Sephadex G-100兩個色譜單元，最終得到較純的甲殼糖脫乙酰酶。

2012年美國專利(US2012009627A1)和中國專利(CN 105039464A)公布了N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰基酶(EC 3.5.1.25)、N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰基酶(EC3.5.1.33)、殼多糖脫乙酰酶和酰基轉移酶的基因修飾、發酵工藝和酶反應條件。

酶提取效率的高低一方面取決于原料中雜質的成分組成、目標物和雜質的理化性質差異、目標產物的相對濃度等因素。目前關于N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶提取方法的公開文獻比較少，與之性質和功能相近的甲殼糖脫乙酰酶則相對較多，但仍主要是在實驗室規模下實現，基本步驟包括鹽沉析富集和多級色譜純化，分離步驟多，提取相關的材料昂貴，且分離過程使用的試劑通常為有機溶劑，不利于綠色安全生產，且最終產品的回收率較低。

發明內容