[發明專利]一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法

在審

• 申請號: 202110871342.0
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113607942A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 吳同壘;史秋梅;張志強;柳翠翠;付祥;白和平;周詩淼;劉勃興
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/38;C12N15/70;C07K14/06
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，屬于生物工程技術領域。本發明公開的一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，對傳染性鼻氣管炎病毒gL蛋白進行原核表達和純化，作為包被抗原，建立了牛傳染性鼻氣管炎的間接ELISA檢測方法。本發明方法具有良好的敏感性、特異性、重復性等，可以用于大規模臨床樣品檢測，為牛傳染病鼻氣管炎疫苗免疫后的抗體水平檢測和檢疫防控提供了重要的技術手段。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，更具體的說是涉及一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法。

背景技術

牛傳染性鼻氣管炎病(Infections bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一種接觸性傳染病,臨床上以嚴重的呼吸道感染，結膜炎，流產，外陰陰道炎，龜頭炎等為主要特征。感染牛常呈現隱性感染，進而不斷傳染其他健康牛，在牛群免疫力低下或發生應激時，可發展為急性感染，造成大量經濟損失，世界動物衛生組織(OIE)將該病列為B類疫病，也是我國進境動物必檢疾病之一。近年來，國內關于牛發生IBR的報道迅速增加。分析其原因主要包括幾個方面：一是牛繁育基地往往不是牛肉或牛奶產地，不同地區間牛運輸頻繁，二是從國外輸入精液，胚胎、種牛等動物或動物產品時，存在漏檢的情況，三是集約化養殖導致IBR的傳播速度加快，陽性率增高。

有效控制牛傳染性鼻氣管炎病毒發生擴散的關鍵所在是建立快速準確的檢測方法。針對IBR的檢測往往采用iELISA方法，試劑盒多為進口，成本較高，國產試劑盒較少，供應量嚴重不足，且存在漏檢等問題。IBRV屬皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，有囊膜，分子量大，編碼70余種蛋白，其中，gL蛋白分子量約為17kDa，主要功能為介導病毒對宿主細胞的侵入和病毒在細胞間的擴散，可誘導產生抗體。

因此，提供一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA(iELISA)的建立方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，具體步驟如下：

(1)制備IBRV重組gL蛋白，對蛋白進行純化，獲得純化的蛋白；

(2)以步驟(1)獲得的純化的蛋白為包被抗原檢測IBRV血清樣本，同時確定抗原包被濃度、抗原包被條件、血清稀釋度、封閉液種類、封閉條件、血清孵育時間、二抗稀釋度、孵育條件及顯色時間；

(3)確定間接ELISA的臨界值：臨界值＝平均值+2×標準差；平均值為陰性血清間接ELISA結果的平均值，標準差為陰性血清間接ELISA結果的標準差；間接ELISA結果判定標準：IBRV血清樣本的OD值大于等于臨界值判斷為陽性，IBRV血清樣本的OD值小于臨界值判斷為陰性；

(4)分析間接ELISA方法的特異性、敏感性和重復性。

進一步，步驟(1)所述制備IBRV重組gL蛋白的步驟如下：

1)PCR擴增gL基因；

2)構建重組質粒pET32a-gL；

3)將重組質粒pET32a-gL轉化E.coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行PCR和雙酶切驗證，獲得陽性克隆，提取pET32a-gL質粒，測序；

4)將pET32a-gL質粒轉化大腸桿菌感受態BL21(DE3)中，利用IPTG誘導，純化后獲得重組gL蛋白；

5)利用SDS-PAGE和WesternBlot鑒定重組gL蛋白。