[發明專利]一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法

在審

• 申請號: 202110871342.0
• 申請日: 2021-07-30
• 公開（公告）號: CN113607942A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 吳同壘;史秋梅;張志強;柳翠翠;付祥;白和平;周詩淼;劉勃興
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12N15/38;C12N15/70;C07K14/06
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)制備IBRV重組gL蛋白，對蛋白進行純化，獲得純化的蛋白；

(2)以步驟(1)獲得的純化的蛋白為包被抗原檢測IBRV血清樣本，同時確定抗原包被濃度、抗原包被條件、血清稀釋度、封閉液種類、封閉條件、血清孵育時間、二抗稀釋度、孵育條件及顯色時間；

(3)確定間接ELISA的臨界值：臨界值＝平均值+2×標準差；平均值為陰性血清間接ELISA結果的平均值，標準差為陰性血清間接ELISA結果的標準差；間接ELISA結果判定標準：IBRV血清樣本的OD值大于等于臨界值判斷為陽性，IBRV血清樣本的OD值小于臨界值判斷為陰性；

(4)分析間接ELISA方法的特異性、敏感性和重復性。

2.根據權利要求1所述的一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，其特征在于，步驟(1)所述制備IBRV重組gL蛋白的步驟如下：

1)PCR擴增gL基因；

2)構建重組質粒pET32a-gL；

3)將重組質粒pET32a-gL轉化E.coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行PCR和雙酶切驗證，獲得陽性克隆，提取pET32a-gL質粒，測序；

4)將pET32a-gL質粒轉化大腸桿菌感受態BL21(DE3)中，利用IPTG誘導，純化后獲得重組gL蛋白；

5)利用SDS-PAGE和WesternBlot鑒定重組gL蛋白。

3.根據權利要求2所述的一種基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA的建立方法，其特征在于，步驟1)PCR擴增所用引物序列如下：

gL-F：5’-GAGGATCCCTGGCGGCGCTGCTGTGGCTCC-3’；SEQ ID NO.1；BamH I；

gL-R：5’-ATGAATTCCTAGCGGTAGATGCCGTCGCC-3’；SEQ ID NO.2；EcoR I。

4.權利要求1-3任一項所述的基于gL蛋白檢測IBR的間接ELISA方法在鑒別牛傳染病鼻氣管炎中的應用。