[發明專利]一種用于重組蛋白表達的啟動子及其應用

有效

• 申請號: 202110864017.1
• 申請日: 2021-07-29
• 公開（公告）號: CN113528527B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 周勉;歐陽雅琦;許寧
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

本發明公開了一種用于重組蛋白表達的甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇，所述甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇的基因組DNA序列包括如NCBI登錄號為NC_012963.1的5’端起第2416633位至第2417632位所示的堿基序列。本發明還公開了一種用于重組蛋白表達的組成型啟動子P₀₄₇₂，所述組成型啟動子P₀₄₇₂的基因組DNA序列包括如NCBI登錄號為NC_012964.1的5’端起第874193位至第875192位所示的堿基序列。本發明的甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇和組成型啟動子P₀₄₇₂可以在大規模生物反應器和/或小規模生物反應器的重組蛋白表達中的應用。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，是關于一種用于大規模生物反應器和/或小規模生物反應器的重組蛋白表達的啟動子及其應用。

背景技術

甲基營養型畢赤酵母是應用最廣泛的重組蛋白表達系統之一。迄今為止，已通過該系統成功表達了5000多種蛋白質。大多數情況下，蛋白質表達依賴于甲醇誘導型啟動子P_AOX1(酒精氧化酶I啟動子)。此外，GAP啟動子(P_GAP)是最常見無需誘導的組成型啟動子。

除P_AOX1和P_GAP外，畢赤酵母中還報道了一些其他啟動子，例如谷胱甘肽依賴型甲醛脫氫酶啟動子(P_FLD1)和二羥基丙酮合酶啟動子(P_DAS)。Prielhofer等人鑒定了P_G1和P_G6，它們由低濃度葡萄糖誘導并被甘油抑制。除誘導型啟動子外，還報道了一些組成型啟動子，包括翻譯延伸因子1(TEF1)啟動子、GTPase(YPT1)啟動子和潛在的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GCW14)啟動子。Ahmad、Hirz、Pichler和Schwab提供了來源于畢赤酵母中的上述啟動子的總結(Protein?expression?in?Pichia?pastoris:recent?achievements?andperspectives?for?heterologous?protein?production)。然而，由于表達強度、誘導條件和調節嚴格性方面的各種缺陷，這些啟動子并未得到廣泛使用。例如，P_FLD1的誘導不僅需要甲醇作為唯一碳源，還需要硫酸銨作為氮源；許多啟動子如P_G1、P_G6和少數組成型啟動子的強度不足以支持大規模的重組蛋白表達。因此，啟動子在畢赤酵母中的應用相當有限，這就需要篩選其他新的強啟動子。

發明內容

為鑒定新的誘導型或組成型啟動子，本發明基于三種不同碳源(葡萄糖、甘油和甲醇)條件下的畢赤酵母野生型GS115菌株RNA-seq數據和mRNA折疊自由能(ΔG)選擇了?16個候選啟動子。在這些啟動子后插入GFP報告基因和重組α-淀粉酶以測試它們的表達強度和誘導能力。最后，本發明確定了兩個有希望用于重組蛋白表達的新型啟動子：甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇和組成型啟動子P₀₄₇₂。經實驗，使用α-淀粉酶作為報告蛋白，?P₀₅₄₇和P₀₄₇₂的啟動子強度在搖瓶實驗中與P_AOX1和P_GAP相當，但在補料分批培養中分別比?P_AOX1和P_GAP高5-10％和25-30％。

因此本發明的第一個目的在于提供一種用于大規模生物反應器和/或小規模生物反應器的重組蛋白表達的甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇和組成型啟動子P₀₄₇₂。

本發明的第二個目的在于提供一種甲醇誘導型啟動子P₀₅₄₇或組成型啟動子P₀₄₇₂在大規模生物反應器和/或小規模生物反應器的重組蛋白表達中的應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：