[發明專利]一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 202110864013.3
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN113651885B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 嚴景華;高福;李燕;馬素芳;仵麗麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;G01N33/569;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫藥技術領域。本發明以大腸桿菌表達的黃熱病毒E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期患者的PBMCs中篩選到可以特異結合黃熱病毒E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT?PCR及PCR擴增，獲得抗體的可變區片段，并進一步與恒定區連接至表達載體中。本發明獲得的6株人源抗體均有很強的YFV中和活性，IC50值達0.03～3.5ug/mL，可以完全或部分保護小鼠免受致死劑量的YFVChina的攻擊。本發明的6株人源抗體有著臨床治療或預防YFV感染的應用價值。

本申請是原申請號為CN201810302091.2，原申請日為2018年04月04日，發明名稱為一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種高靈敏度的黃熱病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫藥技術領域。

背景技術

黃熱病毒（yellow fever virus，YFV），單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種蚊媒傳播的可引起人類致病的病原體，同一科病毒還包括寨卡病毒（zikavirus，ZIKV）、登革病毒（dengue virus，DENV）、西尼羅病毒（west nile virus，WNV）等。YFV是引起黃熱病的重要病原，嚴重時會引起出血熱伴隨多器官衰竭，尤其是肝、脾、淋巴結、心、腎。

在1996年時，科學家曾估計每年在非洲和南美洲黃熱病毒可引起20萬人感染，30萬人死亡。近兩年，巴西、安哥拉和剛果民主共和國等地發生了黃熱病暴發，已造成數百人死亡，死亡率達14%，中國在2016年有11例輸入病例。目前，臨床上已有減毒疫苗（YFV 17D），但疫苗短缺和接種率不足導致疾病頻繁爆發，非免疫個體仍處于危險之中。在YFV感染后，臨床上沒有可用于治療該疾病的有效的特異性藥物。

迄今為止，中和抗體已被證明是治療病毒性疾病的有效方法，包括人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒和其它黃病毒等。黃病毒表面的E蛋白（Envelope）識別細胞表面的受體，進而促進病毒膜與細胞膜發生膜融合，由三個不同的結構域（DI，DII和DIII）完成這些過程。因此，E蛋白是機體免疫系統產生的中和抗體作用的重要表位。

已有研究發現有一些人源抗體具有中和活性，可以中和2001年之前的部分黃熱病毒毒株，如：5A、7A、R3(27)等可以中和 Central African Republic (CAR) 1986、Ethiopia1961、Senegal1990、Nigeria1987、 Ghana 1927 (Asibi)和疫苗株YFV 17D。然而，RNA 病毒在抗體壓力下，具有高突變的特性，盡管已經有些中和抗體被鑒定，但是更多的針對不同表位的新的抗體對于治療是必不可少的。本發明的目的是鑒定特異的具有保護作用的新的YFV中和抗體。

發明內容

為了解決上述問題，本發明首先以大腸桿菌表達的YFV-E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期YFV患者的PBMCs中篩選到可以特異結合YFV-E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT-PCR和PCR擴增，獲得6株抗體的可變區片段，并進一步與恒定區連接至表達載體中。測序正確后，經哺乳動物細胞表達、純化，進行一系列的功能檢測，包括與YFV-E蛋白的結合力，體外中和效果，體內保護能力等檢測。

本發明的第一個目的是提供一種抗體，如（1）~（6）任一所示：

（1）抗體命名為YD2，其重鏈可變區含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，輕鏈可變區含有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

（2）抗體命名為YD25，其重鏈可變區含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，輕鏈可變區含有 SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

（3）抗體命名為YD62，其重鏈可變區含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，輕鏈可變區含有 SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；