[發(fā)明專利]SFV-helper質(zhì)粒、pSFVCs-LacZ病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110822407.2
• 申請(qǐng)日: 2021-07-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113549652A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方倪冉;楊斌;鄭航輝;楊小云;董楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華農(nóng)（肇慶）生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86;C12N5/10;C12N9/38
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 胡楓;李素蘭

本發(fā)明公開(kāi)了一種SFV?helper質(zhì)粒，其是通過(guò)構(gòu)建如SEQ ID NO.1所示的重組載體，并合成如SEQ ID NO.2所示的插入片段基因，再將所述插入片段基因克隆入所述重組載體而得。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供一種pSFVCs?LacZ病毒樣顆粒及其制備方法，包括：(1)構(gòu)建所述SFV?helper質(zhì)粒；(2)將pSFVCs?LacZ、SFV?helper質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后將mRNA共電轉(zhuǎn)入BHK細(xì)胞中，得到pSFVCs?LacZ病毒樣顆粒。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供SFV?helper質(zhì)粒、pSFVCs?LacZ病毒樣顆粒的應(yīng)用。實(shí)施本發(fā)明，能高效表達(dá)β?半乳糖苷酶，并具有較好的生物安全性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種SFV-helper質(zhì)粒、pSFVCs-LacZ 病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

糖香酶，亦稱糖香水解酶，是一大類可水解糖香鍵的酶類的總稱，可用于寡糖的合成，還可用于炫基糖香以及芳香基糖香的合成，在催化氨基酸、多肽、生物堿和抗生素等物質(zhì)的糖基化方面也起到重要的作用，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。β-半乳糖香酶是一類重要的糖香酶，由Lacz基因編碼的β-半乳糖苷酶廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中。

RNA復(fù)制子是衍生于RNA病毒基因組并能自主復(fù)制的RNA。最常用于開(kāi)發(fā)復(fù)制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(Alphavirus),如辛德比斯病毒 (Sindbis virus,SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequine encephalitis virus,VEE)；除甲病毒外，還有黃病毒、小RNA病毒、副粘病毒、杯狀病毒等。被改造用于RNA復(fù)制子的表達(dá)載體本文以甲病毒(塞姆利基森林病毒)載體為例，闡明RNA復(fù)制子疫苗的基本原理和特點(diǎn)。甲病毒是一類正鏈RNA病毒(75)，基因組長(zhǎng)約11-12kb，5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’有多聚腺苷酸結(jié)構(gòu)，有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，可以編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2，NS3，NS4)和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(Core，E3，E2，6K， E1)。甲病毒基因組中位于NS3和NS4間存在一個(gè)終止密碼子，有時(shí)候密碼子通讀時(shí)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)更大的多聚蛋白P1234。但是在某些甲病毒基因組中，如 SINV和O’n yong-nyong virus(ONNV)，此終止密碼子被Arg或Cys密碼子替換，因此不能產(chǎn)生P123多聚蛋白。而這一現(xiàn)象很有可能是一種潛在的發(fā)病機(jī)制。多聚蛋白P1234在NS2蛋白的水解作用下，自切割產(chǎn)生P123和NS4 蛋白。同時(shí)，P123和NS4蛋白可以作為病毒復(fù)制酶，以基因組RNA為模板合成負(fù)鏈RNA。此后，負(fù)鏈RNA亦可以作為模板合成正鏈的基因組RNA和亞基因組RNA(subgenomic RNA)。隨后，P123多聚蛋白被水解產(chǎn)生NS1和P23蛋白，導(dǎo)致負(fù)鏈RNA合成減少，而正鏈基因組RNA合成增多。P23多聚蛋白的半衰期極短，僅為數(shù)秒，而后被水解形成NS2和NS3蛋白。此時(shí)，以單體形式存在的NS1、NS2、NS3、NS4蛋白結(jié)合形成復(fù)制復(fù)合體，進(jìn)一步促進(jìn)病毒基因組和亞基因組RNA的復(fù)制。

本發(fā)明以塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)為載體，它包括兩個(gè)獨(dú)立的RNA分子,一個(gè)RNA分子是包含插入了RNA復(fù)制子載體。另一個(gè) RNA分子是輔助RNA。如何利用塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV) 為載體構(gòu)建一種包裝體系，使其能夠高效表達(dá)β-半乳糖苷酶，對(duì)β-半乳糖香酶在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有重大的意義。然而，如何利用塞姆利基森林病毒進(jìn)行高效表達(dá)β-半乳糖苷酶，目前尚未文獻(xiàn)記載。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，其以塞姆利基森林病毒為載體，提供一種SFV-helper質(zhì)粒、pSFVCs-LacZ病毒樣顆粒及其制備方法，能高效表達(dá)β-半乳糖苷酶。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題還在于，提供SFV-helper質(zhì)粒、pSFVCs-LacZ 病毒樣顆粒的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種pSFVCs-LacZ病毒樣顆粒的制備方法，包括：