[發明專利]雙殼貝類感染皰疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等溫擴增引物、試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202110821722.3
• 申請日: 2021-07-21
• 公開（公告）號: CN113293239B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 辛魯生;于江南;白昌明;王崇明
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 陳娟

本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種雙殼貝類感染皰疹病毒OsHV?1的通用型RPA核酸等溫擴增引物、試劑盒及其應用。所述引物為成套擴增引物，由上下游引物和探針引物組成；上游引物如SEQ ID NO.1所示；下游引物如SEQ ID NO.2所示；探針引物如SEQ ID NO.3所示。本發明針對目前已知四種雙殼貝類宿主中7種OsHV?1變異株，設計了通用的RPA擴增檢測引物，建立了OsHV?1的試紙條RPA檢測體系和方法，該技術對OsHV?1的現場快速篩查和檢測，具有重要價值，具有廣闊的市場應用前景。

技術領域

本發明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種雙殼貝類感染皰疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等溫擴增引物、試劑盒及其應用。

背景技術

雙殼貝類中感染流行的皰疹病毒Ostreid Herpesvirus 1, OsHV-1， 隸屬皰疹病毒目（Herpesvirales），軟體動物皰疹病毒科（Malacoherpesviridae），OsHV-1廣泛流行于全球沿海貝類養殖或捕撈產區。目前已知可感染OsHV-1的雙殼貝類宿主主要包括牡蠣、扇貝及蚶科貝類等，近些年在我國受此類病毒感染較為嚴重的是蚶科養殖貝類，此類病毒感染頻繁導致了我國沿海地區泥蚶、毛蚶及魁蚶群體大規模死亡。不同物種中感染OsHV-1存在一定程度變異，基因組間相似度在90%左右，形成了多個OsHV-1變異株。建立針對OsHV-1通用型現場檢測方法可有效監控此類病毒的流行情況，避免因此類病毒感染造成養殖雙殼貝類大規模死亡。

目前檢測OsHV-1的方法主要有電子顯微鏡法、常規或熒光定量PCR等。電子顯微鏡需要昂貴的儀器；聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術以其能夠檢測痕量的病原DNA而一直被作為診斷多種疫病的金標方法。但常規PCR需要特殊的熱循環設備、其產物仍需電泳檢測，熒光定量PCR具有較高的靈敏性，但反應過程時間長、需要具備熒光探測和分析的儀器。現有的OsHV-1檢測方法由于上述缺陷無法滿足疫病現場診斷的需求。研發適合用于OsHV-1現場診斷的技術對于有效控制OsHV-1流行具有重要意義。

基于重組酶-聚合酶的核酸擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是由英國公司TwistDx Inc開發，該技術依賴重組酶介導引物與目標片段序列結合，使核酸擴增反應脫離了傳統PCR反應必須經歷的變性、退火和延伸的熱循環步驟，進一步觸發聚合酶對目標片段進行指數擴增。最佳反應溫度在37℃-42℃，反應速度快，10~20分鐘即可獲得可檢出水平的擴增產物。針對RPA擴增產物的檢測，實時熒光RPA可對擴增反應進程實時監控，但需要能激發并檢測熒光基團的恒溫儀器，比如可控溫酶標儀或熒光PCR儀；相比而言，試紙條RPA對硬件條件要求更低，只需完成控溫擴增反應，隨后通過側向流層析試紙條讀取試驗結果。因此，試紙條RPA更適合于現場檢測的應用。目前，雙殼貝類感染皰疹病毒OsHV-1檢測過程對儀器設備具有依賴性，且無法做到現場快速檢測。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種能夠實現現場快速檢測的雙殼貝類感染OsHV-1的通用RPA恒溫擴增引物。

本發明還提供了含有上述通用RPA恒溫擴增引物的試劑盒。

本發明還提供了上述通用RPA恒溫擴增引物及試劑盒的應用。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明提供了一種雙殼貝類感染皰疹病毒OsHV-1的通用型RPA核酸等溫擴增引物，所述引物為成套擴增引物，由上下游引物和探針引物組成；

上游引物如SEQ ID NO .1所示：

5’- ATTACCGACATGCCTGACAGATTAAAGGTAGATCA -3’；

下游引物如SEQ ID NO .2所示：