[發(fā)明專利]一種珊瑚礁區(qū)長棘海星幼蟲分子監(jiān)測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110813599.0
• 申請日: 2021-07-19
• 公開（公告）號: CN113337621B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅鵬;李卓波;夏淑蓉;馬波;胡超群;任春華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發(fā)明公開了一種珊瑚礁區(qū)長棘海星幼蟲分子監(jiān)測方法。該監(jiān)測方法包括以下步驟：1)標(biāo)準(zhǔn)參照長棘海星幼蟲DNA模板制作；2)珊瑚礁區(qū)浮游動(dòng)物物樣品的過濾收集；3)珊瑚礁區(qū)收集浮游動(dòng)物樣品DNA的提?。?)浮游動(dòng)物樣品PCR擴(kuò)增及檢測。PCR檢測中采用了一對長棘海星PCR檢測的的特異引物。正向引物：AcanP?TF:GCACGATTTGTCTCTGCCAA；反向引物：AcanP?TR:AGTCCTTCTCTCGCCAGGT。如果在785bp處有目的條帶為長棘海星幼蟲陽性，如果沒有則陰性。通過本發(fā)明的方法可以對長棘海星幼蟲進(jìn)行監(jiān)測，可以提前對長棘海星種群爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)警，從而達(dá)到更早期、及時(shí)防控的目的。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物分子標(biāo)記定量監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種珊瑚礁區(qū)長棘海星幼蟲分子監(jiān)測方法。

背景技術(shù)：

珊瑚是熱帶海洋中重要的生物資源，對于維護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。長棘海星是一種主要以珊瑚為食的棘皮動(dòng)物，長棘海星食量大、破壞力強(qiáng)，其種群爆發(fā)可造成珊瑚礁大面積死亡，因此長棘海星被認(rèn)為是對珊瑚破壞力最大的敵害生物。如何防控長棘海星成為珊瑚礁管理工作者最為關(guān)注的問題之一。在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)大量長棘海星成體出現(xiàn)時(shí)，珊瑚礁已經(jīng)從底部開始受到破壞，因此缺乏更早的預(yù)警方法，達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)，防患于未然的目的。對長棘海星幼蟲的監(jiān)測，可以提前預(yù)警種群爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，從而達(dá)到更早期、及時(shí)防控的目的。然而到目前為止，國內(nèi)外均未見對長棘海星幼蟲進(jìn)行監(jiān)測的方法。

在中國海域長棘海星的性成熟的高峰為6-9月份，雌體海星單次產(chǎn)卵量高達(dá)300萬枚，因此即使少數(shù)長棘海星能夠產(chǎn)卵，單次也可產(chǎn)生數(shù)億規(guī)模的長棘海星幼體。長棘海星幼體最長時(shí)間的階段主要營浮游生活，通過我們觀察發(fā)現(xiàn)，從原腸胚期開始，其體長就達(dá)到200μm以上，這為去除原生動(dòng)物、微藻等大部分浮游生物，快速在珊瑚礁區(qū)海水中快速收集長棘海星幼體提供了便利條件。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一對鑒別長棘海星幼蟲的檢測引物。

本發(fā)明的鑒別長棘海星幼蟲的檢測引物，包括：

正向引物：AcanP-TF:GCACGATTTGTCTCTGCCAA，序列如SEQ ID NO.1所示；

反向引物：AcanP-TR:AGTCCTTCTCTCGCCAGGT，序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種珊瑚礁區(qū)長棘海星幼蟲分子監(jiān)測方法，其包括以下步驟：

1)標(biāo)準(zhǔn)參照長棘海星幼蟲DNA模板制作；2)珊瑚礁區(qū)浮游動(dòng)物樣品的過濾收集；3)珊瑚礁區(qū)收集浮游動(dòng)物樣品DNA的提取；4)浮游動(dòng)物樣品PCR擴(kuò)增及檢測，PCR檢測中采用了上述引物，如果在785bp處有目的條帶，則為長棘海星幼蟲陽性，如果沒有則陰性。

優(yōu)選，所述的長棘海星幼蟲參照DNA模板，是設(shè)有多個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)長棘海星幼蟲參照DNA陽性模板，可以根據(jù)海水樣品DNA擴(kuò)增后與標(biāo)準(zhǔn)參照DNA模板擴(kuò)增后目的條帶的亮度，檢測采集點(diǎn)的幼蟲密度。

優(yōu)選，所述的珊瑚礁區(qū)浮游動(dòng)物樣品的過濾收集是采用淺水2型浮游生物網(wǎng)進(jìn)行珊瑚礁區(qū)海水中浮游動(dòng)物樣品的采集，樣品采集深度為0.5-10m，過濾水體后，從外部沖洗，將浮游動(dòng)物濃縮于網(wǎng)的底部，收集海水，得到樣品海水；將尼龍濾膜(100μm/50mm)用鑷子，裝入濾器當(dāng)中，采用注射器抽取樣品海水，過濾于濾膜上，過濾完后，取出濾膜，表面噴淋一層95％的酒精到濕潤既可，放到采樣管或離心管中保存。

優(yōu)選，所述的DNA的提取是用無菌鑷子取出附著有浮游動(dòng)物樣品的濾膜，用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)吹干濾膜，采用無菌剪刀將濾膜剪碎，連同濾膜一起采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取濾膜上生物樣品的DNA，采用10mM Tris-Cl緩沖液洗脫，保存，得到DNA。