[發明專利]丙酮酸脫氫酶的突變體及其用于生產L-氨基酸的方法

有效

• 申請號: 202110794028.7
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113249347B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發明（設計）人: 鄭平;陳久洲;孫際賓;蔡檸勻;郭軒;周文娟;劉岯;劉嬌;馬延和
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12P13/04;C12P13/08;C12P13/12;C12P13/06;C12R1/19;C12R1/15
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明提供的丙酮酸脫氫酶突變體，其在氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基礎上，且其217位突變為丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一個。所述突變體可以提高菌株L?氨基酸的產量和轉化率，且在提高產量的同時，沒有抑制菌株的生長，為大規模生產L?氨基酸提供了新的途徑，具有較高的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種丙酮酸脫氫酶的突變體，編碼該突變體的多核苷酸，含有該突變體的宿主細胞，以及利用該突變體生產L-氨基酸的方法。

背景技術

丙酮酸脫氫酶多酶復合物（PDHC）是一組限速酶，在谷氨酸棒桿菌中，PDHC催化糖酵解過程產生的丙酮酸不可逆地氧化脫羧轉化成乙酰輔酶A，將糖的有氧氧化與三羧酸循環和氧化磷酸化連接起來，是三羧酸循環的關鍵酶。PDHC由丙酮酸脫氫酶（E1p）、二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶（E2p）和二氫硫辛酰胺脫氫酶（E3p）組成。酶具有無活性（磷酶化）和有活性（去磷酸化）兩種形式，這一點與磷酸化酶不同。有多種別構調節劑調控二種酶形式的轉換，并受激素活動影響。

其中，E1p酶由aceE基因編碼。已有報道弱化AceE的表達可以提高棒桿菌L-氨基酸的產量。CN106715687A也報道了AceE 190-205位或415-440位的任一氨基酸突變可提高谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸的產量。目前，尚未有新的突變位點被報道。

發明內容

本發明根據對AceE結構預測的結果，對217位進行了飽和突變，發現部分突變體可顯著宿主細胞L-賴氨酸的產量，在此基礎上，完成本發明。

本發明的目的是提供一種新型的丙酮酸脫氫酶突變體，含有該突變體的宿主細胞，以及利用含有該突變體的宿主細胞生產L-賴氨酸的方法。

第一方面，本發明提供了一種新型的丙酮酸脫氫酶突變體，所述突變體為：

1）氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且其217位為丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一個。

2）與SEQ ID NO:1同源性高于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的多肽，且在對應于SEQ ID NO:1的217位為丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一個。

3）在SEQ ID NO:1所示多肽的兩端添加、缺失一個或多個堿基，且在對應于SEQ IDNO:1的217位為丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸中的任一個。優選地，在SEQ IDNO:1所示多肽的兩端添加、缺失1、2、3、4、5、6個堿基。

第二方面，本發明提供了編碼丙酮酸脫氫酶突變體的編碼多核苷酸。

第三方面，本發明提供含所述的丙酮酸脫氫酶突變體的編碼核苷酸的表達盒。所述編碼核苷酸與啟動子可操作連接。

第四方面，本發明提供了含有丙酮酸脫氫酶突變體的編碼核苷酸的載體，尤其是表達載體。

第五方面，本發明提供了含有丙酮酸脫氫酶突變體的編碼核苷酸的宿主細胞。

進一步地，所述宿主細胞包括但不限于埃希氏桿菌屬(genus Escherichia)、歐文氏菌屬(genus Erwinia)、沙雷氏菌屬(genus Serratia)、普羅維登斯菌屬(genusProvidencia)、腸道菌屬(genus Enterobacteria)、沙門氏菌屬(genus Salmonella)、鏈霉菌屬(genus Streptomyces)、假單胞菌屬(genus Pseudomonas)、短桿菌屬(genusBrevibacterium)、棒狀桿菌屬（genus Corynebacterium）的微生物。可選地，所述宿主細胞為谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌。優選地，所述宿主細胞包括但不限于谷氨酸棒桿菌ATCC13032，谷氨酸棒桿菌ATCC13869、谷氨酸棒桿菌ATCC 14067及其衍生菌株。