[發明專利]一種檢測脂滴和/或蛋白質聚集體的雙功能熒光探針及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 202110793851.6
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113603654B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 龍凌亮;袁芳;劉衛國;陳倩;李璐璐;陳曉東;何丹
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C07D265/38
• 分類號: C07D265/38;C09K11/06;G01N21/64
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1.一種檢測脂滴和/或蛋白質聚集體的雙功能熒光探針的制備方法，所述雙功能熒光探針的結構為：其特征在于，制備步驟如下：

步驟1、稱取間二乙氨基苯酚溶于濃鹽酸和水的混合溶液中，再稱取亞硝酸鈉溶于水中；隨后將間二乙氨基苯酚的鹽酸溶液置于冰浴環境下，再逐滴加入亞硝酸鈉溶液，滴加完畢后，繼續在冰浴條件下攪拌反應，反應結束后，過濾，收集，洗滌固體，重結晶，提純，得到5-(二乙氨基)-2-亞硝基苯酚的紅色晶體；

步驟2、將5-(二乙氨基)-2-亞硝基苯酚溶解在無水乙醇中，然后滴加水合肼，在惰性氣體保護下，將鈀碳催化劑加入到混合物中，最后將獲得的溶液加熱至回流，然后攪拌直至溶液的紅色消失，得到2-氨基-5-(二乙基氨基)苯酚溶液；

步驟3、將丙酮酸乙酯逐滴滴加到步驟2所獲得的溶液中，隨后在回流溫度下攪拌反應，反應結束后，室溫下冷卻，隨后減壓蒸餾除去溶劑，將殘余物通過柱層析色譜法進行純化，得到黃色固體A，即7-二乙胺基-3-甲基-氮雜香豆素；

步驟4、將步驟3得到的黃色固體A溶解在乙醇中，然后將該溶液滴加在氫氧化鈉水溶液中，將所得混合物在室溫下攪拌反應，然后用鹽酸溶液將混合物中和至中性，再用二氯甲烷和水對混合溶液進行萃取，將收集的有機相在減壓蒸餾下去除溶劑，然后將殘留物質通過柱色譜法進行純化，得到的深紅色固體A，即2-氨基-7-(二乙胺基)-3H-苯并惡嗪-3-酮；

步驟5、將步驟4得到的深紅色固體A用N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后將碘甲烷逐滴滴加到混合溶液中，并向混合物中加入碳酸鉀，然后將混合物加熱攪拌反應，反應結束后，將混合溶液置于室溫下冷卻，隨后用水和二氯甲烷對混合物進行萃取，保留有機相，將收集的有機相通過減壓蒸餾除去溶劑，最后通過柱層析法進一步純化得到固體，即得到了用于檢測生物體中脂滴和/或蛋白質聚集體的雙功能熒光探針。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟1中，所述間二乙氨基苯酚、濃鹽酸、和亞硝酸鈉的用量比為3～6g：6～12mL：1.5～3g；所述冰浴條件下攪拌反應的溫度為-10～-5℃，時間為2-3h；洗滌固體時用飽和的乙酸鈉溶液，重結晶是通過丙酮重結晶，重結晶的溫度為90℃。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中，所述無水乙醇、5-(二乙氨基)-2-亞硝基苯酚、水合肼和鈀碳催化劑的用量比為6mL～12mL：1g～2g：4mL～8mL：0.1g～0.2g，其中，水合肼的體積百分濃度為85％；所述加熱回流攪拌反應的溫度為80～90℃，時間為1～2h。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中，所述丙酮酸乙酯的用量和步驟2中5-(二乙氨基)-2-亞硝基苯酚的用量比為4mL～8mL：1g～2g；所述加熱回流攪拌反應的溫度為80～90℃，時間為3～4h。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中，黃色固體A、乙醇、氫氧化鈉水溶液的用量比為0.5g～1g：10mL～15mL：20mL～40mL，其中，氫氧化鈉水溶液的濃度為10M；所述室溫下攪拌反應的時間為0.5～1h。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5中，所述深紅色固體A、N,N-二甲基甲酰胺、碘甲烷、碳酸鉀的用量比為0.1g～0.2g：10mL～20mL：25μL～50μL：90mg～180mg；所述加熱攪拌溫度為60℃，所述加熱攪拌時間為12～16h。

7.將權利要求1～6任一項制備方法所得的雙功能熒光探針用于制備檢測脂滴和/或蛋白質聚集體試劑的用途。

8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，將所述的雙功能熒光探針用于制備檢測組織或細胞中的脂滴和/或蛋白質聚集體試劑。