[發明專利]一種同時定量檢測血清中3種急性心肌梗死相關microRNA熒光探針的制備方法

在審

• 申請號: 202110789084.1
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113373216A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 胡琴;程霞;岑瑤;許貫虹;魏芳弟
• 申請（專利權）人: 南京邁迪森亞生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/682
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

本發明公開了一種同時定量檢測血清中3種急性心肌梗死相關microRNA熒光探針的制備方法：合成金屬有機骨架Fe?MIL?88；發夾探針H1～H9與Fe?MIL?88發生熒光共振能量轉移作用，發夾探針上標記的FAM(H1?H3),TAMRA(H4?H6),Cy5(H7?H9)的熒光被猝滅，當存在目標物時，520nm處FAM的熒光隨著目標物miR?21濃度增加而增強，580nm處TAMRA的熒光隨著目標物miR?499濃度增加而增強，680nm處Cy5的熒光隨著目標物miR?133a濃度增加而增強；根據相應熒光強度對目標物的濃度進行定量檢測。該方法靈敏度高、選擇性好、檢測簡便。

技術領域

本發明屬納米材料、熒光傳感技術和生物分析檢測領域，具體涉及基于金屬有機骨架的信號放大熒光傳感平臺同時定量測定血清中3種急性心肌梗死相關microRNA的方法。

背景技術

急性心肌梗死(AMI)伴有血管腔狹窄、急性持續缺氧缺血性心肌缺血和損傷，且可導致嚴重殘疾和超高死亡率，是最常見的一類冠狀動脈綜合征。目前，高靈敏性心肌肌鈣蛋白(hs-cTnT)被認為是診斷AMI的金標準。然而，在慢性穩定型冠狀動脈疾病(應激性心肌病和血管痙攣型心絞痛)和終末期腎病(腎功能衰竭)中，血漿hs-cTnT也會有明顯的升高。此外，在最新的高靈敏免疫測定法下，cTnT在6小時67左右才能有顯著升高。因此，尋找更好的潛在生物標志物對于醫學研究中早期快速、準確診斷AMI顯得尤為重要。

MicroRNA是一種短的內源性非編碼RNA(17-25個核苷酸)，通過調節基因轉錄后水平的表達，在生物過程中發揮重要作用。越來越多的證據表明，心肌組織特異性表達microRNA，如microRNA-21(miR-21)、microRNA-499(miR-499)、microRNA-208a和microRNA-133a(miR-133a)，且它們在循環中也高度穩定。值得注意的是，miR-21能夠增強AMI中干細胞和祖細胞的功能，導致AMI后纖維形成和細胞肥大。而心肌和骨骼肌中的miR-499在生理上與心臟分化和I/R損傷相關，是再灌注損傷潛在的生物標志物。并且，miR-133a在早期分化、心臟發育和介導心臟傳導、自律性、肥厚和心臟重構等過程中發揮著重要作用。此外，甚至在AMI事件后的1小時內，血漿和血清中相關microRNA的表達水平在患者血流中迅速顯著上調。在這個意義上，這些microRNA可以被認為是AMI的早期診斷和快速預后潛在的生物標志物。目前，已有多種檢測AMI相關microRNA的定量分析方法報道，如實時聚合酶鏈反應、微陣列、northern blot、表面增強拉曼光譜等。然而，由于microRNA尺寸小，豐度低和同源性高等特點，導致這些技術存在耗時及缺乏靈敏度的不足。另一方面，傳統方法僅基于單一的AMI相關microRNA檢測，不可避免地會產生假陽性或假陰性結果。為了克服這些障礙，迫切需要將信號放大技術與多路復用技術相結合。

為了進一步提高同時定量檢測多個AMI相關microRNA的靈敏度，我們引入了納米材料。近年來，由于納米材料如金納米顆粒、碳納米管、氧化石墨烯、二硫化鉬納米片、金屬有機框架(MOFs)等具有良好的結構和優異的光學性能而受到越來越廣泛的關注。特別是MOFs，一種獨特的新型納米多孔有機-無機材料，具有超高的表面積、柔性孔隙率和良好的熱穩定性。MOFs在催化、氣體儲存與分離、化學傳感和藥物遞送等方面的應用已被廣泛報道。此外，一些MOFs包括UiO-66和MIL-101已經被設計用于DNA傳感。這些MOF對各種染料標記的單鏈DNA展現出極好的熒光猝滅能力以及對單鏈DNA和雙鏈DNA有較好的區分能力。但是，基于MOFs和染料標記的DNA鏈的一步雜交的檢測方法信號較弱，限制了其靈敏度。然而，借助催化發夾組裝(CHA)輔助的目標物循環，可以有效放大檢測信號，這有利于進一步提高靈敏度。據我們所知，通過結合CHA放大技術和金屬有機骨架的熒光測定技術用于多路microRNA分析，具有極好的靈敏度和特異性，目前仍未被廣泛探索。

發明內容