[發(fā)明專利]梅毒螺旋體16s RNA的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及其專用引物和探針

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110788905.X
• 申請(qǐng)日: 2021-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN113502341A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 居金良;崔振玲;耿玥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海仁度生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 北京尚誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發(fā)明公開一種梅毒螺旋體16s RNA的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及其專用引物和探針，屬于生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的試劑盒包括核酸提取液、檢測液a、檢測液b和SAT酶液，通過優(yōu)化設(shè)計(jì)更適合于梅毒螺旋體16s RNA檢測的引物和探針，并在檢測過程中分步添加各組分進(jìn)行分步反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)梅毒螺旋體16s RNA的快速、準(zhǔn)確檢測，并且靈敏度高，擴(kuò)增產(chǎn)物RNA易降解不會(huì)引起樣本交叉污染和環(huán)境污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種梅毒螺旋體16s RNA的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒及其專用引物和探針，特別涉及特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)(Simultaneous Amplification and Test，SAT)結(jié)合的梅毒螺旋體(treponema pallidum，TP)16s RNA的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測中使用的引物、探針及相關(guān)試劑盒。

背景技術(shù)

梅毒是一種由梅毒螺旋體引起的傳染性疾病，其可通過直接性接觸傳播、母嬰傳播或通過輸血、哺乳、梅毒患者接觸的衣、物(例如物體表面附著物、飲用水、食品等)或其唾液等傳播，可侵犯皮膚黏膜、心血管、神經(jīng)、骨骼等造成多系統(tǒng)損害，也可使妊娠期婦女發(fā)生流產(chǎn)、死胎和分娩先天梅毒兒。因此及時(shí)檢出早期梅毒患者，以進(jìn)行針對(duì)性治療，并控制傳染源，是控制梅毒傳播的重要措施。

目前，對(duì)梅毒進(jìn)行檢測的方法主要包括：梅毒非特異性血清學(xué)試驗(yàn)(RPR、TRUST等)、梅毒的特異性血清學(xué)試驗(yàn)(TPPA、TPHA等)、雙抗原夾心法ELISA和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)。其中梅毒的血清學(xué)診斷方法對(duì)確定感染及治療很有意義，但對(duì)早期梅毒診斷不敏感，對(duì)先天性及神經(jīng)性梅毒的診斷不夠特異；雙抗原夾心法ELISA多用于對(duì)梅毒進(jìn)行大規(guī)模篩查，當(dāng)其常存在敏感性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差的缺陷；實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法由于其高靈敏度、高特異性和檢測結(jié)果可靠準(zhǔn)確等優(yōu)勢，在梅毒檢測中發(fā)揮重要的價(jià)值。例如專利文獻(xiàn)CN102816857A(以下稱文獻(xiàn)1)公開一種梅毒螺旋體核酸檢測試劑盒，其采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)梅毒螺旋體的最低檢出限達(dá)到5.0×10²copies/mL。專利文獻(xiàn)CN104561317A(以下稱文獻(xiàn)2)公開一種梅毒螺旋體熒光PCR檢測試劑盒，其基于熒光PCR的基本原理，首先利用包括0.01～0.5mmol/L的莎梵婷、50～200mmol/L的氯化鉀、質(zhì)量百分含量為0.01％～2％的十二烷基磺酸鈉和體積百分含量為0.05％～1％的乙醇的核酸釋放劑提取核酸，隨后利用特異性設(shè)計(jì)的熒光PCR引物和探針實(shí)現(xiàn)對(duì)梅毒螺旋體的最低檢出限可達(dá)400copies/ml。

然而，上述文獻(xiàn)1和文獻(xiàn)2公開的方法均基于熒光PCR的基本原理，PCR反應(yīng)過程中需要溫度的升降和循環(huán)，因此所需檢測時(shí)間較長，效率較低，同時(shí)需要使用熒光定量PCR儀，增加了檢測成本；另外，PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為DNA，不易降解，容易導(dǎo)致樣本交叉污染和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的污染；再者，雖然以上文獻(xiàn)1和文獻(xiàn)2對(duì)梅毒螺旋體的檢測靈敏度的最低限可以達(dá)到400～500copies/ml，但仍不能滿足更高檢測靈敏度的要求。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的一個(gè)或多個(gè)問題，本發(fā)明一個(gè)方面提供一種梅毒螺旋體16s RNA的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒，其包括：

(1)核酸提取液：其包含含有特異性捕獲探針的固相支持物和第一引物，其中所述捕獲探針用于捕獲檢測序列，所述第一引物用于與靶標(biāo)序列特異性結(jié)合；

(2)檢測液a：其包含第二引物，所述第二引物與所述第一引物配合，用于擴(kuò)增靶標(biāo)序列；

(3)檢測液b：其包含第一引物和靶標(biāo)檢測探針，其中所述靶標(biāo)檢測探針與所述靶標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物RNA拷貝特異性結(jié)合；

(4)SAT酶液：其包含至少一種RNA聚合酶和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶；

其中所述第一引物包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少99％同源性，且能夠與所述靶標(biāo)序列特異性結(jié)合的核苷酸序列；