[發明專利]一種豬睪丸間質祖細胞的長期培養方法

有效

• 申請號: 201610087719.2
• 申請日: 2016-02-16
• 公開（公告）號: CN105624105B
• 公開（公告）日: 2020-01-21
• 發明（設計）人: 白銀山;張守全;馮美瑩;朱翠;衛恒習;李莉
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 11246 北京眾合誠成知識產權代理有限公司
• 代理人: 龔燮英

本發明公開了一種豬睪丸間質祖細胞PLCs的長期培養方法，其中包括體外分離、檢測和分化，利用豬PLCs的體外增殖培養基培養仔豬睪丸成纖維細胞5～8天后，得到PLCs克隆集落；利用豬PLCs的分化培養基進行培養后，第3天PLCs開始向成熟睪丸間質細胞分化，然而在增殖培養基中培養，在體外最長維持時間達到了6個月。本發明首次建立起一套成熟的豬PLCs的分離、培養、檢測和分化的完善方法，最終確立的不同體外培養體系可以實現控制PLCs在體外維持增殖和分化。本發明的方法對于體外研究PLCs生物學性質，以及藥物研發和疫苗生產等方面應用具有潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于干細胞技術領域，更具體地，本發明涉及一種豬睪丸間質祖細胞的長期培養方法，包括體外分離、檢測與分化的方法。

背景技術

在雄性動物睪丸組織中，眾所周知在生精小管內側壁存在著源源不斷產生的精子的一類保持自身數量恒定的精原干細胞；然而在生精小管外側壁還存在另一類維持增殖與分化平衡的干細胞，它是睪丸間質干細胞(leydig stem cells,SLCs)，SLCs在經歷睪丸間質祖細胞(progenitor leydig cells,PLCs)、未成熟睪丸間質細胞(immature leydigcells,ILCs)等階段后，形成具有分泌睪酮功能的成熟睪丸間質細胞(adult leydigcells,ALCs)，雄性動物體內95％左右的睪酮是由ALCs分泌，對于維持雄性動物體內睪酮水平的動態平衡具有重要作用。

雄激素睪酮是雄性動物體內最為重要的激素之一。幼年時期對于性器官和副性器官的生長和發育發揮重要作用，而且對肌肉和骨骼的發育也起到重要作用；雄性動物在青春期出現第二性征，進入成年期后對維持性功能、正常的精子生成起決定性作用。男性睪酮缺乏綜合癥是目前影響男性健康與生育能力的主要原因。

然而關于SLCs生物學數據并不多，主要是來自嚙齒動物的研究， 而其他物種的情況還不清楚。研究發現SLCs特異性高水平表達PDGFRa和白血病抑制因子受體蛋白(LIFR)，但不表達LHR和類固醇代謝相關的酶(CYP11a1、CYP17a1、StAR和3β-HSD)等基因。其中PDGF因子廣泛存在生精小管的管周的細胞中，對于促進SLCs的分化有重要的作用。PLCs是由SLCs分化而來的一類中間階段的干細胞，具有和SLCs類似形態特征，成紡錘狀，但是基因表達發生了很大的改變，主要表現在出現了類固醇代謝相關酶(CYP11a1、CYP17a1和StAR)和少量的的LHR表達，但并沒有3β-HSD的表達，同時它還保留SLCs的標記LIFR和PDGFRa的表達，表現出分裂能力強的特征。

睪酮合成過程相當復雜，膽固醇作為原料，在一系列的酶(CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD和17β-HSD)及蛋白(SR-B1、StAR、PBR)的作用下轉變成為睪酮。而(SF-1、Nur77、PPARγ、AhR、NFκB、CREB、GATA-4、花生四烯酸、磷酸酯酶、TGF-α、GRTH、SREBP等)等轉錄因子通過調控靶基因而影響相應的酶及蛋白的表達水平來調控睪酮合成。下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic–pituitary–testicular,HPT)調節系統所分泌的物質(LH、FSH、PRL、GnRH、E2、OT、VP、鈣離子和堿性成纖維細胞生長因子等)也具有調控間質細胞的睪酮分泌的活動。膽固醇作為原料在StAR的作用下，從ALCs的線料體外膜轉運到膜內；接著，被側鏈裂解酶細胞色素CYP11A1催化而變成孕烯醇酮；然后，孕烯醇酮在17-羥化酶/17-20裂解酶(CYP17A1)作用下變成17a-羥孕酮； 隨后，被17-羥甾脫氫酶(17-HSD)催化而變為雄烯二酮；最后，被存在于ALCs的光面內質網上3β-HSD催化而變成睪酮。

豬的器官和人類的器官最為接近，所以豬也是人類醫學研究理想的動物模型和異種器官移植的理想材料，同時豬做為畜牧業最重要的一種飼養動物，關系到國計民生。提高種公豬的繁育能力，一直是豬育種研究的重點，雄激素睪酮與雄性動物的生育能力息息相關，所以豬睪丸間質干/祖細胞研究在豬育種研究具有重要的意義，同時也是人類再生醫學良好的模型，意義重大。