[發明專利]利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC的腫瘤免疫治療用途及制備方法

在審

• 申請號: 202110775638.2
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN115590952A
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 周興旺;郝桃方
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N5/0784
• 代理公司: 廣東中億律師事務所 44277
• 代理人: 杜海江

1.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于治療腫瘤的用途。

2.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于治療結直腸癌的用途。

3.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于治療CT-26型結直腸癌的用途。

4.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于制造治療腫瘤的生物藥物的用途。

5.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于制造治療結直腸癌的生物藥物的用途。

6.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC用于制造治療CT-26型結直腸癌的生物藥物的用途。

7.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC疫苗用于治療腫瘤的用途。

8.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC疫苗用于治療結直腸癌的用途。

9.利用無毒弓形體刺激DCs獲得的NRTUA-DC疫苗用于治療CT-26型結直腸癌的用途。

10.利用無毒弓形體刺激DCs制備NRTUA-DC方法，其特征在于其步驟如下：

（1）、取一小鼠并將其處死，然后用酒精浸泡小鼠；

（2）、去除小鼠皮膚，切斷后肢近髖部和遠踝部；

（3）、用PBS在60mm培養皿中解剖小鼠股骨，移除骨骼周圍的肌肉，并暴露骨髓；

（4）、將剝離出來的骨組織浸泡到預冷的PBS中，直至收集到所有骨組織；

（5）、把收集到的所有骨組織先用酒精浸泡，再用無菌的PBS清洗；

（6）、把預冷的PBS倒入100cm培養皿，骨組織轉移到含PBS的培養皿中，將培養皿放入生物安全柜；

（7）、用無菌剪剪斷股骨，用鑷子固定骨，用注射器吸取預冷的PBS來沖洗骨，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至培養皿中，直至股骨完全變白；

（8）、將骨髓轉移至離心管中，放入離心機離心，轉速為1500rpm，離心時間為3min，離心后棄上清液；

（9）、加入ACK裂解緩沖液去除紅細胞，重懸15s，然后進行離心，轉速為1500rpm，離心時間為3min，去除ACK裂解液；

（10）、RMPI1640+10%FBS+1%PS(青霉素、鏈霉素)+55μM 2-β巰基乙醇的基本培養基重懸細胞，并利用細胞篩過濾細胞；

（11）、調整細胞濃度到1-1.6×10⁶個/ml，種于6孔板；

（12）、在培養基中添加細胞因子GM-CSF和IL-4，然后轉移至溫度為37℃，5%CO₂培養箱中培養；

（13）、半定量換液，吸取舊的培養基，換上新的培養基；

（14）、觀察細胞，DCs細胞在第4天生長迅速，需要及時更換培養基和添加細胞因子；

（15）、第5天收集未成熟DCs，利用DCs誘導分化培養基(含GM-CSF和IL-4的培養基)重懸細胞至1×10⁶個/ml；

（16）、復蘇HFF細胞，利用10%DMEM+10%FBS+1%PS維持培養基在37℃，5%CO₂培養箱中培養；

（17）、HFF細胞匯合度達到90%以上時，復蘇無毒弓形體NRTUA，同時更換HFF細胞的培養基，換成含有250μM尿嘧啶的維持培養基，將NRTUA加入到HFF細胞培養瓶中；

（18）、接種了NRTUA的HFF細胞培養瓶放入溫度為37℃，5%CO₂培養箱中培養，4-5天后NRTUA完全破壁并可以進行傳代；

（19）、將破壁后的NRTUA用過濾篩過濾掉細胞碎片，收集過濾后的NRTUA，利用PBS重懸濃度至1-2×10⁷個/ml；

（20）、收集的未成熟骨髓樹突狀細胞（BMDC）利用DCs誘導分化培養基(含GM-CSF和IL-4的基本培養基)重懸細胞至1×10⁶個/ml，重新鋪板到6孔板中；

（21）、收集過濾器過濾的NRTUA，利用PBS重懸濃度至2×10⁷個/ml，以NRTUA:DC=1:1的比例加入到DCs中，每孔加入500μl的NRTUA，輕輕混勻，然后放入溫度為37℃，5%CO₂培養箱中繼續培養48h；

（22）、培養結束后，收集NRTUA-DC，或是未經刺激的DCs，利用PBS重懸濃度至1×10⁷個/ml的濃度，保存在冰上。