[發(fā)明專(zhuān)利]一種NLRP3啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)引物組合物、應(yīng)用及檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110773953.1
• 申請(qǐng)日: 2021-07-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113416783A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧務(wù)國(guó);龍謙;李振江
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 湖南靈康醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 長(zhǎng)沙楚為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43217
• 代理人: 李大為

本發(fā)明公布了一種NLRP3啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)引物組合物、應(yīng)用及檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)包括上游引物cg21919599?F、下游引物cg21919599?Rbio和測(cè)序引物cg21919599?S的檢測(cè)引物組合物，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NLRP3啟動(dòng)子cg21919599甲基化的水平。本發(fā)明所述的NLRP3啟動(dòng)子甲基化水平的檢測(cè)方法靈敏度及準(zhǔn)確性高，對(duì)于腎癌的病理分期及早期檢測(cè)、預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種NLRP3啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)引物組合物、應(yīng)用及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

腎癌是威脅人們健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。我國(guó)腎癌的發(fā)病率近年來(lái)一直處于顯著的上升趨勢(shì)，其發(fā)病率年增長(zhǎng)率高達(dá)5％，成為我國(guó)腫瘤發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的腫瘤之一。早期腎癌局限于腎臟包膜內(nèi)，5年生存期高達(dá)90％以上；但當(dāng)腫瘤擴(kuò)散到包膜外或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤的治療就相當(dāng)困難且預(yù)后較差，5年生存期僅有15％左右。更為重要的是，由于早期腎癌往往無(wú)臨床癥狀，且臨床上缺乏腎癌早期診斷分子標(biāo)志物，有近30％的患者初診即為晚期。因此，臨床上亟需尋找到簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)志物，以實(shí)現(xiàn)腎癌的早期診斷，從而提高腎癌患者的總體生存期。

腎癌早期并無(wú)明顯的癥狀，因其位置較隱蔽，較難發(fā)現(xiàn)。腎癌的診斷，除了依據(jù)“腎癌三聯(lián)征”的臨床癥狀外，主要依據(jù)影像學(xué)檢查，包括腹部超聲(US)、核磁共振成像(MRI)及X射線計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)。超聲檢查目前多用彩色超聲，可以鑒別腎實(shí)質(zhì)性腫瘤和腎囊性腫塊，但是即使超聲造影也很難與其它腎臟實(shí)質(zhì)性病變區(qū)別；CT是目前腎癌診斷最常用和最重要的手段，理論上可以清晰的顯示腎實(shí)質(zhì)瘤的部位、范圍、形態(tài)，可發(fā)現(xiàn)早期癌變的腎臟，增強(qiáng)后腫瘤一般均會(huì)強(qiáng)化，且透明細(xì)胞癌則類(lèi)似于肝癌呈現(xiàn)“快進(jìn)快出”強(qiáng)化方式；MRI可以從各個(gè)角度清晰的顯示腫瘤的形態(tài)，侵犯的范圍及粘連程度，主要是對(duì)腎癌的分期較明確，另外有助于診斷是否合并癌栓。

NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。由于能被多種類(lèi)型的病原體或危險(xiǎn)信號(hào)所激活，NLRP3炎癥小體在多種疾病過(guò)程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括最初被確認(rèn)的家族性周期性自身炎癥反應(yīng)，到II型糖尿病、阿爾茲海默癥和動(dòng)脈粥樣硬化癥等。因此，作為炎癥反應(yīng)的核心，NLRP3炎癥小體可能為各種炎癥性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)。

NLRP3受體蛋白含有PYD、NACHT、LRR三個(gè)結(jié)構(gòu)域，炎癥小體組裝情況下，其PYD結(jié)構(gòu)域和ASC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成同型PYD:PYD相互作用(PPI)，而ASC中的CARD結(jié)構(gòu)域又可以和效應(yīng)蛋白的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成類(lèi)似的CARD:CARD相互作用，這樣ASC在這里起到橋梁作用，連接受體蛋白和效應(yīng)蛋白。在受體蛋白受到激動(dòng)劑刺激時(shí)，通過(guò)以上相互作用最后激活caspase-1，誘導(dǎo)其自切割并活化。活化的caspase-1可以切割并促使細(xì)胞白介素和其他細(xì)胞因子的成熟。而細(xì)胞白介素的釋放對(duì)于細(xì)胞的炎癥反應(yīng)起到重要作用。除此之外，caspase-1的成熟對(duì)于細(xì)胞的死亡也起到不可磨滅的作用。NLPR3的激動(dòng)劑十分廣泛，大體有這幾種：鈣離子的胞質(zhì)壓力、活性氧(ROS)壓力、氫質(zhì)子的胞質(zhì)壓力、鉀離子外流、細(xì)菌mRNA、氧化線粒體DNA壓力、溶酶體不穩(wěn)定等。也正因?yàn)槿绱耍?dòng)劑-受體蛋白具體的作用機(jī)制和信號(hào)軸一直尚不完全清楚。而最近的研究提示，高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的解體可能對(duì)信號(hào)傳遞起到至關(guān)重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種NLRP3啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè)引物組合物、應(yīng)用及檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物組合物，利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NLRP3啟動(dòng)子cg21919599甲基化的水平，該方法靈敏度及準(zhǔn)確性高，對(duì)于腎癌的病理分期及早期檢測(cè)、預(yù)后和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的意義。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：