[發明專利]一種雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法

在審

• 申請號: 202110769239.5
• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN113430175A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 馮新;宋戰昀
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61P31/04
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 劉潔

本發明屬于生物工程技術領域，公開了一種雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法，包括雞白痢沙門菌噬菌體的分離；采用斑點法和雙層瓊脂平板法進行噬菌體的鑒定；采用雙層瓊脂平板法進行噬菌體的純化；噬菌體效價測定：采用雙層瓊脂平板法對噬菌斑計數，根據噬菌體效價與噬菌斑數的關系式對噬菌體效價進行計算。本發明以雞白痢沙門菌臨床分離株為宿主菌，從污水中分離篩選出一株強裂解性噬菌體YSP2，該噬菌體屬于有尾病毒目長尾病毒科，生物學特性穩定，特異性裂解沙門菌，噬菌體YSP2對雞白痢有較好的治療效果，在其與宿主菌同時進入體內時可達到最佳治療效果。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法。

背景技術

目前：雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的常見傳染病，該病一方面對全球養殖業造成嚴重危害及經濟損失；另一方面，由于防控本病的主要方法是使用抗生素類藥物，造成了耐藥菌的產生和禽類產品的抗生素殘留，嚴重危害人類健康。而噬菌體作為細菌的天敵，既可以克服菌株抗藥性及藥物殘留問題，又可以在自然中易于獲取，逐漸被作為抗生素的替代品研究及利用。

雞白痢沙門菌在發展中國家廣泛傳播，給養禽業造成嚴重經濟損失。應用抗生素治療雞白痢仍然在很多國家，尤其是發展中國家中存在。已經發現多種化療藥物可有效減少死亡率，但是并不能消除感染。家禽在結束化療后仍能保持感染性，在普通環境下仍能再次感染。

通過上述分析，現有技術存在的問題及缺陷為：

(1)無有效的清除雞體內及環境中雞白痢沙門菌的制劑。

(2)抗生素可起到一定的防治雞白痢沙門菌作用，但耐藥性問題影響了抗生素的效果。

解決以上問題及缺陷的難度為：雞白痢沙門菌可水平傳播、垂直傳播，且具有胞內寄生特性，環境中的抵抗力較強，因此導致雞體內及飼養環境中雞白痢沙門菌的清除凈化較為困難。

解決以上問題及缺陷的意義為：雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種嚴重危害家禽生產的可經垂直傳播的傳染病，嚴重影響孵化率和出雛率，其感染率一度超過30％，我國《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》將其確定為優先防治病種，對種雞群提出凈化要求。清除和凈化養雞場特別是種雞場環境和雞體內雞白痢沙門菌，對提高養殖效率、節約成本、減少病害具有重要意義。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法。

本發明是這樣實現的，一種雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法，所述雞白痢沙門菌特異性裂解噬菌體的分離純化方法包括：

雞白痢沙門菌噬菌體的分離：將過濾后的水樣和宿主菌加入SC增菌液中，振蕩培養，離心后取上清液過濾；

采用斑點法和雙層瓊脂平板法進行噬菌體的鑒定；采用雙層瓊脂平板法進行噬菌體的純化；

噬菌體效價測定：采用雙層瓊脂平板法對噬菌斑計數，根據噬菌體效價與噬菌斑數的關系式對噬菌體效價進行計算。

進一步，所述雞白痢沙門菌噬菌體的分離具體包括：將采集的水樣用濾紙過濾，除去固體雜質，取過濾后的水樣50mL和宿主菌5mL加入250mL SC增菌液中，置37℃，150r/min振蕩培養16～18h；將混合培養液以4000r/min離心20min去除菌體，取上清液經0.22μm微孔濾膜過濾，濾液即為噬菌體原液。

進一步，所述斑點法包括：首先將宿主菌均勻涂布于LB固體培養基上，待其干燥后，吸取5μL噬菌體原液滴于培養基上，37℃倒置培養10～12h；若為陽性結果即瓊脂平板上出現透明斑，則說明噬菌體存在。