[發明專利]微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110761466.3
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113604537A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: 姜昊;鄧昭敏
• 申請（專利權）人: 四川普羅海爾斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：進行研磨組織，制備細胞懸液并提取細胞核的步驟；

S2：進行轉座及純化的步驟；

S3：進行PCR富集，并構建文庫及片段篩選的步驟；

S4：進行文庫質檢的步驟。

2.根據權利要求1所述的微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于，S1：進行研磨組織，制備細胞懸液并提取細胞核的步驟具體包括：

將微量冷凍組織放入盛有1X HB unstable buffer的2ml玻璃研磨器中，冰上靜置5分鐘；

使用第一研磨棒研磨組織約10-15次后把這一步中的溶液用細胞過濾篩過濾到新的50mL離心管中；再使用第二研磨棒研磨約20次，把這一步中的溶液用細胞過濾篩過濾后，于4℃，350RCF環境離心5min；

吸棄上清加入350L預冷的1xHB，重懸混勻；加入400μL的50％Iodixanol Solution，混勻；

將600μL的30％Iodixanol Solution碘克沙醇溶液加入25％的溶液層之下；

將600μL的40％iodixanol Solution碘克沙醇溶液加入30％的溶液層之下；

冷凍離心機的制動設為0，并在4℃，3000RCF環境下離心20min，吸取細胞核層溶液，加入適量的預冷的ATAC-RSB-Tween稀釋后，臺盼藍計數；

計數8000個細胞核，加入1mL預冷的ATAC-RSB-Tween溶液并混勻。

3.根據權利要求1所述的微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于，進行轉座及純化的步驟中進行轉座的步驟如下：

將步驟S1提取的細胞核加入到包含5×TTBL10μL，TTEMix V50 5μL，ddH2O 17.5μL，PBS16.5μL的轉座反應體系中，置于PCR儀中并在37℃條件下反應30min。

4.根據權利要求1所述的微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于，進行轉座及純化的步驟中進行純化的步驟如下：

使用Qiagen MinElute PCR purification Kit(250)加入250μl的PB buffer進行混勻；

轉移到Column中，室溫靜置5min后于8000rpm室溫環境下離心1min；

棄去收集管中的液體，向Column中加入750μl的PE buffer，于室溫13000rpm環境下離心1min；

棄去收集管中的液體，并在室溫10000rpm環境下離心1min；

將Column轉移到新的1.5ml Lo-Bind離心管中，開蓋靜置3min；

加入11μl ddH2O，滴加到膜上，室溫靜置5min，并在室溫10000rpm環境下離心1min。

5.根據權利要求1所述的微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于：進行PCR富集的具體步驟如下：

以步驟S2純化的DNA產物為模板，配制50μL的反應體系：

轉座后的DNA 10μl，5×PCR MIX 25μl，N5XX 5μl，N7XX 5μl，ddH2O 5μl，混勻后按照以下條件擴增：72℃延伸5分鐘，98℃預變性30秒；

按以下參數擴增5個循環：98℃變性10秒，63℃變性30秒，72℃延伸1分鐘，最后12℃Hold。

6.根據權利要求5所述的微量冷凍組織ATAC-seq測序文庫的構建方法，其特征在于，使用qPCR確定最低限度循環PCR擴增的次數，quantitative PCR(qPCR)15μl反應體系具體如下：

擴增了5次的DNA 5μl，100×SYBR Green I 0.06μl，2×2PCR MIX 5μl，與上述相同的N5XX 0.25μl，N7XX 0.25μl，ddH2O 4.44μl；

混勻后按照以下條件進行：98℃30秒，20個循環：98℃10秒，63℃30秒，72℃1分鐘。