[發明專利]葡萄砧木特異性分子標記及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 202110756537.0
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113930531B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 吳永興;謝魏魏;王曉菲;鐘醒宇;黃曉毅
• 申請（專利權）人: 尼秀媚;周揚顏;山東大豐園農業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6809;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京曼京知識產權代理事務所(普通合伙) 11965
• 代理人: 郜文剛

本發明公開了3種葡萄砧木特異性分子標記及其篩選方法和應用，包括下列步驟：（1）提取葉片基因組DNA；（2）按照簡化基因組測序技術Super?GBS方法構建文庫，文庫質檢合格后上機測序；（3）對測序數據進行過濾后，使用GATK獲得SNP位點，并對SNP進行過濾，以提高SNP的準確性；（4）根據每個品種的分型結果篩選3種葡萄砧木中至少有一個品種與其他兩個品種不同的位點；（5）最終篩選到5842個鑒定3種葡萄砧木的SNP位點，在這些SNP位點當中，根據每個位點能夠區分砧木的類別可以組合出幾百組能夠高效鑒別3種葡萄砧木的SNP位點標記群。本發明基于這些位點標記開發出兩種簡便、快速、可靠鑒定3種葡萄砧木的方法，為從源頭準確控制葡萄品種奠定技術基礎。

技術領域

本發明涉及3種葡萄砧木特異性分子標記及其篩選方法和應用，屬于生物技術領域。

背景技術

葡萄根瘤蚜于19世紀中期從美國東部傳到歐洲，在25年內幾乎摧毀了法、意、德的葡萄和釀酒業。由于美洲野生種葡萄對根瘤蚜有抵抗能力，1870年Gaston?Bazille提出將歐洲葡萄嫁接于美洲葡萄上，由此確定了采用砧木防治根瘤蚜的技術路線，這也是果樹栽培史上唯一一個因為一種害蟲而需要嫁接栽培的實例。至今，世界葡萄主產區大都采用了抗性砧木嫁接栽培。

中國對葡萄砧木的探索不以抗線蟲和抗根瘤蚜為主要研究方向，其研究重點是抗寒性砧木，其次是抗干旱、鹽堿和病蟲害等，進入21世紀，在葡萄酒產業和設施栽培特別是避雨栽培的帶動下，中國葡萄產業快速擴張，葡萄栽培區域不斷向西、向南發展，目前全國葡萄栽培面積達到55.2萬hm2，總產量843萬噸，但大部分葡萄園為自根系苗建園，使用抗性砧木嫁接苗栽培的比例仍然很低。隨著世界性檢疫害蟲葡萄根瘤蚜在南北方多點的發生，以及中國大陸季風氣候帶來的冬季寒冷干燥和土壤鹽堿等生態逆境的威脅，葡萄嫁接栽培在中國具有廣闊的應用潛力，但我國有關于葡萄砧木的研究起步較晚，研究成果較少。

法國和德國是最早從事葡萄抗性砧木育種的國家，其采用河岸葡萄、沙地葡萄和冬葡萄作為親本進行雜交。主要有3個雜交組合群體，除了都抗根瘤蚜以外，其耐石灰質、耐旱能力及形成的樹勢或產量有明顯不同。①河岸葡萄與沙地葡萄雜交組合。生產上主要使用101?-14Mgt、3309C兩個品種，較抗根癌病，較耐寒，較抗根結線蟲能促進嫁接品種早熟，產量低，品質好。②河岸葡萄和冬葡萄雜交組合。育成品種有420A、SO4、5BB、5C、8B等，是目前生產上使用最多的類型。耐濕不耐旱，抗根結線蟲，抗寒性強，根系較淺，樹勢中庸偏旺，促進接穗長勢，產量中等或偏高。③沙地葡萄和冬葡萄雜交組合。育成的砧木也是目前生產上特別是在干旱地區廣泛使用的砧木，如99R、110R、140Ru、1103P、1447P、225Ru?等。抗旱，根系分布深，耐瘠薄，嫁接生長勢旺，產量高，使接穗品種生長期延長。

本發明開發的葡萄砧木鑒定品種主要是河岸葡萄與沙地葡萄典型后代101-14、河岸葡萄和冬葡萄雜交典型后代5BB及沙地葡萄和冬葡萄典型后代1103P，這3個品種也是目前應用最多的品種，通過本發明能夠準確鑒定3種常用葡萄砧木，為葡萄砧木的精準生產提供技術支持。

發明內容

本發明提供一種3種葡萄砧木的特異性分子標記的篩選方法，并應用該方法篩選到5842?個品種特異的SNP標記，基于這些標記開發出兩種簡便、快速、可靠鑒定3種葡萄砧木的方法，為從源頭上準確控制葡萄品種奠定技術基礎。

本發明采用下述技術方案予以實現：

首先，本發明提供一種利用簡化基因組測序技術Super-GBS篩選3種葡萄砧木的特異性分子標記的方法，包括如下步驟：

(1)利用品種已知且準確的6株1103P、6株5BB和5株101-14葡萄砧木為樣品，取葉片提取基因組DNA；

(2)按照簡化基因組測序技術Super-GBS方法構建文庫，文庫質檢合格后上機測序；

(3)對測序數據進行過濾后，使用GATK獲得SNP位點；