[發明專利]核酸連接酶

有效

• 申請號: 202110754255.7
• 申請日: 2021-07-01
• 公開（公告）號: CN113481174B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 丁春明;楊政權;金勝男
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12P19/34
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;李唐

本發明涉及核酸連接酶，其包含與現有技術的Hyperligase(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列相比，在選自79位、281位、370位和372位的一個或多個位置具有突變的氨基酸序列。本發明還涉及編碼所述酶的核酸分子、包含所述核酸分子的載體，以及包含所述核酸分子或所述載體的重組細胞。此外，本申請還涉及包含所述酶的組合物以及所述酶的用途。

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體涉及基于現有技術的核酸連接酶進行突變而得到的新的核酸連接酶。本發明還涉及包含所述酶的產品。

背景技術

核酸連接酶是一種金屬離子依賴性酶，催化DNA或RNA相鄰的3’末端與5’末端之間形成磷酸二酯鍵，實現底物樣品的分子內環化或分子間線性連接反應。核酸連接酶根據催化底物的不同可分為DNA連接酶和RNA連接酶。部分連接酶可催化DNA與RNA之間的連接反應^[1，2]。根據物種來源的不同，天然的核酸連接酶具有多種獨特的特性，如底物特異性、序列偏好性、熱穩定性、耐鹽、耐pH變化等。

一般認為，完整的核酸連接反應分為三個階段進行^[1]。第一階段，連接酶與ATP或NAD⁺的腺苷基團結合，將ATP或NAD⁺中的腺苷基團轉移至酶的保守基序中的賴氨酸殘基，釋放出焦磷酸鹽，并形成酶和腺苷的中間體。該步驟是一種平衡反應，能夠雙向進行。在第二階段，酶和腺苷的中間體將其腺苷基團轉移至核酸底物的5’磷酸末端，形成5’腺苷酰化的中間產物。該步驟也是一種平衡反向，能夠雙向進行。第三階段，酶的賴氨酸催化位點與核酸的3’羥基末端結合，攻擊核酸的5’腺苷酰化末端，催化二者之間形成磷酸二酯鍵，完成連接反應。常見的連接酶一般以5’磷酸化的核酸為底物，催化連接反應完整的三個階段，實現連接反應^[3，4]。

連接酶是分子克隆技術、高通量測序文庫制備、基因合成和分子診斷等常用分子生物學方法的基礎，在分子生物學研究和分子診斷技術中占據重要地位^[5，6]。按照酶的反應溫度的不同，可將連接酶分為熱穩定型和非熱穩定型兩類。目前，用于雙鏈DNA或RNA連接反應的連接酶較多，但用于單鏈DNA連接反應的酶僅有極其有限的選擇，能夠在較高溫度下(如＞65℃)進行單鏈連接的熱穩定連接酶更少。

目前已經有幾種熱穩定單鏈核酸連接酶報道。熱穩定TS2126連接酶(商品名為CircLigase)能夠直接在65℃催化5’磷酸末端與3’羥基末端之間的連接反應^[7]，但催化具有末端序列偏好性，導致底物的選擇性連接^[7]，造成結果的偏差。基因突變后的Mth RNA熱穩定連接酶(商品名為Thermostable 5′AppDNARNA Ligase)同樣能夠在較高溫度下催化單鏈核酸之間的連接反應，但其用于單鏈DNA連接反應時連接效率較低^[8]。另一種能夠在較高溫度下催化單鏈DNA之間連接反應的酶Taq DNA連接酶雖然具有較高的連接效率，但需要以互補鏈為模板作為引導，無法單獨用于單鏈核酸的連接反應。

酶的改造和修飾主要有基因突變、基因融合、化學修飾、抗體修飾和核酸適配體修飾等方法。對部分連接酶進行基因突變改造能夠改變連接酶的特性，提高連接酶的熱穩定性或連接效率，改善連接酶的耐鹽性或耐酸性等。對Mth RNA連接酶核心賴氨酸的突變能夠使其直接以預腺苷酰化的單鏈DNA為底物進行連接反應，提高其連接效率^[8]。對超級耐熱丁酸棲高溫菌Hyperthermus butylicus來源的Hbut_1550基因編碼的蛋白質核心賴氨酸進行基因突變賦予了該蛋白質單鏈DNA/RNA連接的能力，研究人員因此將其改造為熱穩定DNA/RNA連接酶(被命名為Hyper-Thermostable Lysine-Mutatant ssDNA/RNA Ligase，以下簡稱HyperLigase，WO2017160788A3)。HyperLigase ssDNA/RNA Ligase具有很高的熱穩定性，能夠在較高的溫度范圍內(如37-95℃)催化5’預腺苷酰化底物與3’羥基末端之間的連接反應。盡管如此，上這一基因工程改造后的連接酶仍然存在連接效率不夠高的缺陷。