[發明專利]一株解淀粉芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 202110737301.2
• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113512513B
• 公開（公告）日: 2022-10-25
• 發明（設計）人: 金明飛;葉天韻;黃靜;楊婷;馬妍;吳雅婷;常忠義
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N9/10;C12N15/75;C12R1/07
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務所 31319
• 代理人: 夏思秋

本發明公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其應用，屬于生物技術領域。本發明提供了一株產胞外蛋白能力和淀粉能力強的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA?HS；將此菌株接種至發酵培養基中發酵，即可使發酵上清淀粉酶的表達量高達60U/mL；以此菌株為宿主表達編碼1,4?α?葡聚糖分支酶的基因構建得到的重組菌接種至發酵培養基中發酵，可得發酵上清中1,4?α?葡聚糖分支酶的酶活最高達300U/mL。本發明方法在自然界篩選出解淀粉芽孢桿菌，根據特性分析找到淀粉酶和蛋白酶較高的菌株，針對性地探索野生解淀粉芽孢桿菌的電轉條件，并對其進行優化，從而提高轉化效率并成功表達異源蛋白。

技術領域

本發明屬于微生物應用技術領域，涉及一種解淀粉芽孢桿菌及其應用。

背景技術

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種廣泛分布、嗜溫、好氧并產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，已被美國食品藥品管理局(FDA)認定為GRAS(Generallyrecognized as safe)菌株。解淀粉芽孢桿菌不僅具有很強的抗逆性，還能能分泌大量酶類和產生抗菌物質，因此，一方面作為活菌劑被廣泛應用在飼料、生防、環保等領域，另一方面作為表達系統在外源蛋白和代謝產物的生產中發揮重要作用。解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌具有很高的同源性，同時兩者在遺傳上和生化特征上存在種間差異。與枯草芽孢桿菌相比，解淀粉芽孢桿菌具有更強的蛋白分泌能力。目前，解淀粉芽孢桿菌是許多α-淀粉酶和蛋白酶等酶制劑的重要生產菌株。

盡管解淀粉芽孢桿菌具有優良的蛋白表達和分泌特性，然而相比于枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌在外源蛋白表達方面的研究相對較少。這是由于解淀粉芽孢桿菌內存在DNA限制性內切修飾系統，并且外源質粒的穩定性差。限制性內切修飾系統由限制性內切酶和相應的甲基酶組成，這些酶可以識別并切斷未被修飾的外源DNA，從而作為細菌細胞的防御工具。由于外源基因轉化失敗率高，所以很少有可靠的解淀粉芽孢桿菌作為宿主用于重組蛋白的生產。

目前，解淀粉芽孢桿菌的轉化方法主要有：1)自然轉化；2)原生質體轉化；3)電擊轉化；4)原生質體電擊轉化。其中，電轉化是一種快速、簡單的轉化方法。電轉化的作用原理是在一定的電場強度作用下，細胞膜上形成可恢復的疏水性小孔以便外源DNA進入胞內。理論上電場強度越大，細胞表面產生的疏水性小孔越多，細胞膜通透性越好，外源DNA約容易進入胞內，但是細胞的死亡率也會隨著電場強度的增加而增加。對于電轉化方法，如何在轉化率和細胞死亡率之間找到一個平衡點，建立最佳的電擊條件非常重要。

為了改進電轉的條件，已經有研究人員做出以下方面的貢獻：1)在電擊洗滌緩沖液中加入蔗糖、山梨醇、甘露醇或海藻糖之類的滲透劑，提高電擊時細胞的存活率；2)優化細菌的收集時間或向液體培養基中加入一些能夠抑制細胞壁合成的物質，如D(L)-蘇氨酸、甘氨酸、抗生素(如氨芐青霉素)、溶菌酶或吐溫-80等。3)對外源DNA進行內外或體內甲基化修飾，以克服宿主體內存在的限制修飾系統，避免被酶切降解。但是這些方法，都有其局限。比如，劉宇帥等人在專利(CN 110423784 A)里提及在電轉培養基里加入甘氨酸能夠使解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.4038的陽性轉化率達到80％，但是早在2011年Zhang等人就在Enhancing electro-transformation competency ofrecalcitrant Bacillusamyloliquefaciens by combining cell-wall weakening and cell-membrane fluiditydisturbing提到加入甘氨酸和DL-蘇氨酸可以削弱細胞壁，補充Tween 80進一步提高細胞膜流動性，從而使得外源質粒在解淀粉芽孢桿菌TA208中的轉化率達到1.13±0.34x10⁷CFU/μg。

而且對于不同的解淀粉芽孢桿菌，也需要針對性地摸索電擊轉化的條件，才能取得較為理想的結果。