[發(fā)明專利]鄰苯二酚雙加氧酶突變體、重組載體及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110693671.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113308444A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江晶潔;馬富強;張藝凡;岳婕;楊廣宇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 賀杰

本發(fā)明公開了一種鄰苯二酚雙加氧酶突變體、重組載體及其制備方法和應(yīng)用，該突變型鄰苯二酚雙加氧酶為如下(a1)或(a2)：(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、替代或增加一個或多個氨基酸得到的與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的多肽具有相同功能的多肽；(a2)與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少90％同源性的多肽。本發(fā)明的突變型鄰苯二酚雙加氧酶包括單點突變體和組合突變體，與野生型鄰苯二酚雙加氧酶相比，其單點突變體和組合突變體在40℃下半衰期均更長；尤其是組合突變體，其半衰期大約是野生型的3倍，表現(xiàn)出單點突變體熱穩(wěn)定性的疊加效果。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鄰苯二酚雙加氧酶突變體、重組載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，工業(yè)廢水污染造成的環(huán)境問題備受關(guān)注。在這些污水中，芳香化合物占具較高比例，而芳香化合物是一類難以降解的有機物質(zhì)，對人體具有毒害作用，如致癌、神經(jīng)毒性等。自然界中，存在著許多具有降解芳香族化合物能力的細菌，如Acinectobactercalcoaceticu、Pseudomonas sp.、Acine tobacter lwoffii、Burkholderia sp.等，可將芳香族化合物作為唯一生長碳源，并完全降解為H₂O和CO₂。鄰苯二酚是芳香化合物降解過程中的一個重要中間產(chǎn)物，而鄰苯二酚雙加氧酶是催化降解過程的關(guān)鍵酶，主要通過鄰位或間位雙加氧酶的作用裂解鄰苯二酚生成粘康酸半醛或粘康酸，從而使苯環(huán)斷裂。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雖然已有很多關(guān)于鄰苯二酚雙加氧酶基因表達方面的研究，但由于其降解對象均為性質(zhì)穩(wěn)定的芳香化合物，一些鄰苯二酚雙加氧酶表現(xiàn)出較低的熱穩(wěn)定性，限制了其工業(yè)化應(yīng)用的過程。因此，有必要對現(xiàn)有鄰苯二酚1,2-雙加氧酶進行酶定向進化改造，提高其熱穩(wěn)定性，從而提升其降解芳香化合物的效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種鄰苯二酚雙加氧酶突變體、重組載體及其制備方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：提供一種突變型鄰苯二酚雙加氧酶(CatA)，所述突變型鄰苯二酚雙加氧酶為如下(a1)或(a2)：

(a1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、替代或增加一個或多個氨基酸得到的與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的多肽具有相同功能的多肽；

(a2)與SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的多肽具有至少90％同源性的多肽。

研究發(fā)現(xiàn)，上述(a1)和(a2)兩者類型的突變型鄰苯二酚雙加氧酶具有較高的酶穩(wěn)定性。經(jīng)試驗驗證，該突變型鄰苯二酚雙加氧酶酶的半衰期最高能得到3倍的提升。

優(yōu)選的是，所述突變型鄰苯二酚雙加氧酶是在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列上進行突變得到的，突變位點選自A95V、L148S、R193Q、L248D中的一種或一種以上的組合。

優(yōu)選的是，所述突變位點為A95V、L148S、R193Q、L248D、A95V-L14 8S、L148S-R193Q、A95V-L248D、R193Q-L248D、A95V-R193Q、L148S-L2 48D、A95V-L148S-R193Q、A95V-L148S-L248D、A95V-R193Q-L248D、L14 8S-R193Q-L248D或A95V-L148S-R193Q-L248D。

優(yōu)選的是，A95V單位點突變對應(yīng)的突變型鄰苯二酚雙加氧酶的氨基酸序列如SEQID No.3所示；

L148S單位點突變對應(yīng)的突變型鄰苯二酚雙加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

R193Q單位點突變對應(yīng)的突變型鄰苯二酚雙加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；