[發明專利]負載蛋白的生物活性磷酸鈣納米顆粒及其制備方法

在審

• 申請號: 202110692136.3
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113368302A
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 王佐林;雷婧詩
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: A61L27/12
• 分類號: A61L27/12;A61L27/22;A61L27/54
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 范艷靜

本發明提供了一種負載蛋白的生物活性磷酸鈣納米顆粒及其制備方法，該制備方法包括將蛋白溶解在三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液中，然后逐滴加入氯化鈣、氯化鎂和磷酸氫二鈉溶液混合均勻，經離心、凍干即可；本發明的方法通過簡單地混合蛋白及無機鹽成分，在敞開環境下快速反應制備具有生物活性的磷酸鈣納米顆粒，該過程方法避免了高溫高壓等苛刻條件，不引入其他有毒成分、操作簡單、反應快速，能夠有效保護生長因子活性，并且實現生長因子的有效負載及釋放的優點，為后續的用于臨床應用提供基礎；另外，本發明的生物活性磷酸鈣納米顆粒尺寸為40nm左右，生物相容性較好，可以有效的保留生長因子活性，促進細胞的增殖、分化。

技術領域

本發明屬于納米材料合成技術領域，具體涉及一種無機離子與生物活性蛋白共沉淀合成，具有生物活性的納米顆粒，即負載蛋白的生物活性磷酸鈣納米顆粒及其制備方法。

背景技術

過去數十年中，許多研究證明了多種生長因子具有高生物活性及生物特異性，在組織修復和再生等生命活動中起重要作用。然而，與大部分蛋白質相似，生長因子在體內大多不穩定，且半衰期短。因此，具有生物活性的蛋白納米載體在能夠保護蛋白活性的同時，還能延長其半衰期，有效地避免反復注射、口服等引起的不良反應。然而，仍然有兩個問題限制了蛋白納米載體的實現：如何有效保護蛋白活性；如何實現蛋白的有效負載及釋放。目前研究較多的蛋白納米載體材料有：氧化石墨烯、磁性納米顆粒、金納米顆粒、脂質體顆粒和聚合物納米顆粒等。其中，磷酸鈣納米顆粒備受關注。

脊椎動物鈣化組織內的主要無機成分即為磷酸鈣類礦物。人工合成的磷酸鈣材料組成結構與生物體內結構相似，并且都具有良好的化學穩定性、生物活性、可降解性及一定的吸附能力。此外，體外實驗表明，磷酸鈣材料具有良好的生物相容性，其生物毒性遠遠低于硅基、量子點、碳納米管磁性顆粒等。其在pH4.2的環境中能夠穩定存在，具有良好的穩定性。并且，納米級磷酸鈣類材料與體內骨組織磷酸鈣的形式高度一致，能夠改善骨組織的增殖，促進成骨細胞黏附，在種植體表面改性中得到廣泛應用。

目前，基于磷酸鈣納米顆粒制備的生物蛋白活性載體可見以下報道：

《材料科學：醫學材料》(J Mater Sci:Mater Med，2010年第21卷1875-1880頁)報道了利用化學沉淀的方法合成羥基磷灰石納米顆粒，在pH＝12的體系中緩慢混合硝酸鈣和磷酸氫二銨，可產生大量沉淀；然后將反應體系煮沸10min，最后離心保留沉淀，冷凍干燥。將凍干后的沉淀溶解于5毫升BMP-2溶液中37℃攪拌反應30min，通過吸附作用負載生長因子BMP-2。反應結束后，離心去除上清，沉淀凍干保存。該方法中生長因子與磷酸鈣納米顆粒僅通過吸附作用結合，易導致蛋白突釋。

《先進健康材料》(Adv.Healthcare Mater.，2013年第2卷682-686頁)報道了一種在溫和的極性環境中，不采用任何有毒表面活性劑微波協同合成多空磷酸鈣的方法。由于沒有引入有毒物質，所以合成出的材料可以直接應用于生物體內而不需要任何后處理過程。同時該納米材料表現出良好的蛋白負載和緩釋的特性。作者進一步基于表征討論了其存在的潛在機理。該方法的反應高溫環境會影響蛋白活性，且蛋白突釋明顯，2h內大部分蛋白已經完全釋放。

發明內容

針對現有技術中的不足，本發明的目的之一是提供一種負載蛋白的生物活性磷酸鈣納米顆粒的制備方法。

本發明的目的之二是提供上述負載蛋白的生物活性磷酸鈣納米顆粒。

本發明的原理：利用化學沉淀的方法，在合成磷酸鈣顆粒的過程中加入蛋白，在制備磷酸鈣納米顆粒的同時將蛋白實現有效地包覆。

為達到上述目的之一，本發明的解決方案是：

將蛋白溶解在Tris-HCL緩沖溶液中，逐滴加入氯化鈣溶液、氯化鎂溶液及磷酸氫二鈉溶液，混合均勻后可見大量沉淀，高速離心，收集沉淀用雙蒸水反復清洗，沉淀冷凍干燥，冰箱冷凍保存。具體地，