[發明專利]SEB標準物質的制備方法及測定SEB標準物質溶液濃度的方法

在審

• 申請號: 202110691147.X
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113433326A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 江華;鄭玉玲;律清宇;劉鵬;孔德聰;姜永強;孫澤雨;黃文華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07K7/06;C07K7/08
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了SEB標準物質的制備方法及測定SEB標準物質溶液濃度的方法。該測定SEB標準物質溶液濃度的方法利用T30和/或T7作為標準品制備標準曲線來測定SEB標準物質溶液的濃度，所述T30是氨基酸序列為序列表中序列1的多肽，所述T7是氨基酸序列為序列表中序列2的多肽。本發明所提供的SEB標準物質的制備方法，包括在培養基中培養金葡菌菌株S?6，收集發酵產物，從發酵產物中純化得到SEB蛋白，純化得到的SEB蛋白即為SEB標準物質。本發明可用于日常檢測的質量控制，將該標準物質用于不同試劑、不同檢測方法檢測下限的確定。

技術領域

本發明涉及SEB標準物質的制備方法及測定SEB標準物質溶液濃度的方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產生的多種重要外毒素之一，具有典型的超抗原性質，不需要抗原提呈細胞(APC)處理而能夠直接與MHCⅡ類分子結合(結合在MHCⅡ類分子抗原肽結合溝槽外側)，導致帶有特異性Vβ節段T細胞大量增殖的抗原分子。超抗原對T細胞的激活不受MHCⅡ類分子的限制，且對T淋巴細胞的激活能力是普通抗原的2,000-50,000倍，因此只需極低濃度(1-10pg/ml)即可激活多克隆T細胞產生很強的免疫應答。

腸毒素中SEB是美國已經公布裝備的八種“標準”生物戰劑之一，也是生物武器核查單上的失能性戰劑。其分子量在23–29kDa，對熱穩定，在室溫下可保持1周以上，適合裝備彈頭，并通過生物戰劑氣溶膠形式釋放；能抗多種蛋白酶降解，在pH4－10均有活性，中毒劑量低，在0.0004μg/kg的劑量下即可使受試者失能達2周時間，對人的致吐劑量僅為0.4μg/kg，少量吸入就可導致嘔吐和腹瀉，13小時內體溫升至41℃以上，引起人體的多器官、多系統的損傷，造成機體免疫功能失調，臨床表現為發熱、低血壓，嚴重的甚至引起致死性休克，具有很高的致殘率。

由于SEB是食物中毒的主要原因，同時也是生物恐怖的潛在威脅，因此必須對監測水、食物的SEB污染發展出快速、敏感、特異的檢測方法。建立檢測方法必須有標準物質作為支撐，而建立SEB標準物質首先需要建立其定值方法。

發明內容

本發明提供測定SEB標準物質溶液濃度的方法，所述方法利用T30和/或T7作為標準品制備標準曲線來測定SEB標準物質溶液的濃度，所述T30是氨基酸序列為序列表中序列1所示的多肽，所述T7是氨基酸序列為序列表中序列2所示的多肽。

進一步地，上述利用T30和/或T7作為標準品制備標準曲線包括將所述T30作為溶質用50％乙腈水溶液作為溶劑配制T30標準品溶液的步驟和將所述T7作為溶質用50％乙腈水溶液作為溶劑配制T7標準品溶液的步驟。

進一步地，上述SEB標準物質溶液是以SEB標準物質為溶質，以SEB裂解液為溶劑配制而成的溶液。

所述SEB裂解液可為溶質為SDC(脫氧膽酸鈉)、TCEP(三(2羧乙基)膦)、CAA(氯乙酰胺)、TEAB(三乙基碳酸氫銨)，溶劑為水的緩沖液。

進一步地，所述SEB裂解液中SDC的質量百分含量為0.1％，TCEP的濃度為10mM，CAA的濃度為40mM，TEAB的濃度為50mM。

進一步地，上述方法中所述利用T30和/或T7作為標準品制備標準曲線來測定SEB標準物質溶液的濃度包括將所述SEB標準物質溶液進行酶解得到酶解產物溶液的步驟，所述酶解產物含有所述T30和所述T7。

進一步地，所述酶解產物中含有的T30和T7摩爾濃度與SEB標準物質的摩爾濃度相同。

進一步地，所述SEB酶解產物制備可包括SEB裂解液的制備步驟；

進一步地，所述SEB酶解產物制備還可包括SEB裂解產物的變性步驟；