[發明專利]一種促進大腸桿菌周質表達單域抗體的方法

有效

• 申請號: 202110687609.0
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN113502309B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發明（設計）人: 畢允晨;鄧鵬輝;王淏
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K16/40;C12N15/13;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 山東三邦知識產權代理事務所(普通合伙) 37308
• 代理人: 高洋;牛繼梅

本發明公開了一種促進大腸桿菌周質表達單域抗體的方法，屬于生物抗體表達技術領域。在誘導表達前對轉化有單域抗體基因的大腸桿菌進行0℃冰激處理，處理5?10min，然后利用低劑量IPTG誘導菌種表達，10?22℃低溫培養，獲得大腸桿菌周質表達的單域抗體。本發明所述方法能夠將單域抗體表達正確定位于周質空間，克服大腸桿菌在定向周質表達重組單域抗體時無法正確分泌而堆積在胞內的缺陷，同時，該方法還能夠有效促進單域抗體在大腸桿菌周質空間中以單體可溶形式高效表達，從而使后續抗體純化和應用易于實現。

技術領域

本發明屬于生物抗體表達技術領域，具體涉及一種促進大腸桿菌周質表達單域抗體的方法。

背景技術

軟骨魚(包括鯊魚、鰩等)和駱駝科(包括單峰駝、雙峰駝、羊駝等)動物的血清中存在著僅由重鏈組成的抗體，其輕鏈天然缺失。由于缺乏輕鏈，這種特殊的抗體起到抗原識別和結合作用的只有重鏈可變區(在軟骨魚類動物中稱為VNAR，在駝類動物中稱為VHH)。

為發揮識別和結合抗原的作用，在體外將這種重鏈可變結構域進行重組表達，形成單域抗體(Single domain antibody)。單域抗體不僅與常規抗體一樣具有良好的抗原識別與結合能力，而且還具有如下優勢：(1)分子量小，作為目前已知具有完整抗體功能的最小分子片段，其組織滲透性高；(2)親水性佳；(3)穩定性強，能耐受苛刻的溫度和pH條件；(4)更加靈活的鉸鏈區，沒有輕重鏈可變區的錯配，使多價抗體的產生更容易；(5)無需糖基化修飾，更加適合細菌表達體系，易于大量制備；(6)具有更長的抗原互補決定區(CDR)，可以結合到常規抗體無法接觸到的抗原縫隙或凹陷表位。受限于培養條件，目前鯊魚來源的單域抗體研究和應用均較少，有著廣闊的開發前景。

大腸桿菌作為傳統生物學模式生物之一，因其易于培養，遺傳背景透徹，是實驗室表達異源蛋白的首選生物。大腸桿菌的細胞壁薄但結構復雜，外膜與細胞膜之間存在周質間隙。根據表達的部位，將外源蛋白表達形式分為三種：(1)胞外分泌表達；細菌將異源蛋白分泌到培養基中，但僅適用于小分子蛋白，且在實驗室中不利于純化；(2)胞質表達；其表達量較大，但細菌胞內為還原性環境，含有二硫鍵的蛋白質往往不能正確折疊并形成二硫鍵，最終容易大量形成無生物功能的包涵體；雖然有些研究從變性復性的角度嘗試恢復包涵體蛋白質的活性，但其工藝繁瑣復雜，復性率低，難以進行大批量的處理；(3)周質表達；周質空間呈現氧化性環境，當中含有促進蛋白質折疊的分子伴侶和幫助二硫鍵正確形成的酶，不僅利于蛋白質中二硫鍵的形成還可以增加蛋白質的溶解性；另外，在周質空間當中蛋白酶含量較低，雜蛋白少，不僅有利于異源蛋白的穩定存在和下游純化，而且能減少異源蛋白對于宿主菌的毒性和代謝負擔。

目前鯊源單域抗體的表達方法不夠成熟，在實際生產應用中，周質表達水平與質粒和目的蛋白本身特性有很大的關系，常常會出現如下問題：

(1)許多單域抗體在大腸桿菌中無法正確表達，或是表達量很低，無法進行后續的應用；

(2)部分單域抗體雖然能夠在胞內表達，但大量形成二聚體或多聚體，或無生物功能的包涵體，無法進行后續應用。

(3)設計定位于周質空間的單域抗體雖然有所表達，但是無法正確分泌至細菌周質，反而堆積在胞內。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種使單域抗體在大腸桿菌周質空間以單體可溶形式高效表達的方法；且該方法克服了大腸桿菌在定向周質表達重組單域抗體時無法正確分泌而堆積在胞內以及表達量低無法分離純化的缺陷。

為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種促進大腸桿菌周質表達單域抗體的方法，步驟如下：

(1)將轉化有單域抗體基因的重組大腸桿菌培養至OD₆₀₀為1.0-1.2；

(2)對步驟(1)中的重組大腸桿菌進行0℃冰激處理，處理5-10min；