[發明專利]新型毛細管分析柱及實現超高靈敏度蛋白質譜檢測方法

在審

• 申請號: 202110662948.3
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113406227A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 戚良
• 申請（專利權）人: 上海君誼生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/72
• 代理公司: 上海隆天律師事務所 31282
• 代理人: 鐘宗

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種新型毛細管分析柱及基于該毛細管分析柱實現超高靈敏度蛋白質譜檢測方法，其中，所述分析柱包括柱管，毛細管整合發射尖端，填充在管腔中的填料，用于支撐填料的熔塊。其中，所述填料為表面光滑、粒徑均一、表面覆蓋有機聚合物的改性硅基微球，其粒徑≤3μm。所述分析柱的內徑≤30μm。本發明采用所述毛細管分析柱對蛋白進行質譜檢測時，通過分流裝置使流速≤1nL/min，并通過高精度的位置控制來實現靈敏控制，在超低流速下能極大地提高質譜靈敏度，并且能夠彌補流速低于Van Deemter最小流速時色譜分辨率的下降，有效提高對含量較低的生物大分子的分析鑒定，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種新型毛細管分析柱、包含所述毛細管分析柱的色譜分析儀或色譜-質譜聯用系統，以及實現超高靈敏度蛋白質譜檢測方法。

背景技術

液相色譜具有對物質如有機化合物的有效分離、分辨能力，而質譜則是準確鑒定大分子的有效手段。由兩者結合構成的液相色譜—質譜聯用技術(LC-MS)，可以在計算機操控下，直接用液相色譜分離復雜混合物中的樣品，使其中的被檢測化合物逐個地進入質譜儀的離子源，可用大氣壓電離(包括電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學電離(APCI))進行電子轟擊或化學離子化，使樣品中所有的化合物都離子化，匯聚成具有一定能量和幾何形狀的離子束，通過揮發性、動量荷電性能等實現與混合物中其他物質的分離，進而通過質譜分析系統進行分析鑒定。

該技術可以適用于高分子量、強極性、低揮發性及對熱不穩定的物質的分離檢測，主要通過LC-MS對整體蛋白質的質譜分析完成。然而，由于在初級或其他核型正常細胞中，細胞的磷酸化位點較少，產生的磷酸化信號較低，易被其它高信號值掩蓋，因此，采用目前的LC-MS分析方法僅能鑒定少數細胞特定的蛋白磷酸化位點。此外，通過細胞種類，蛋白類別或特異翻譯后修飾對富集的生物樣品進行檢測時，獲得的獨立絕對信號值經常超出當前LC-MS儀器分析的動態范圍。

毛細管色譜柱是LC-MS分析中起分離作用的關鍵部件，其制備技術關系到柱性能及其分離能力的好壞，進而對通過后續質譜檢測的結果產生重要影響。新型毛細管柱的開發一直是本領域長期關注和探索的熱點。有報道稱，質譜中樣品引入接口的改進能夠提高結果的檢測限和動態范圍。現有LC-MS蛋白質組學中，對樣品引入接口的改進措施包括使用小內徑柱和小顆粒填充物或使用機器控制的噴嘴，這些方法強調在最優的色譜和電噴霧性能條件下，保證結果的可重復性和穩定性。小內徑柱對色譜分辨率的提高和低流速對電噴霧電離效率的提升均已有文獻進行了報道。然而，當流速繼續降低，例如達到極低流速及以下時(等于或低于Van Deemter最小流速)，電噴電離效率會提升，而色譜分辨率則會下降，這一固有問題是否會影響最終的質譜靈敏度、動態范圍等性能仍未可知。而目前的技術水平，構建支持極低流速的包含小內徑柱(≤30μm)的穩定電噴霧設備較為困難，且現有技術中也未有成功構建這一設備的報道。

發明內容

為克服現有技術存在的缺陷，本發明提供了一種新型小柱徑毛細管分析柱(毛細管色譜柱)以及穩定制作該毛細管分析柱的工藝方法。所述毛細管分析柱可以作為微型化LC-ESI的組件用于LC-MS分析中，將有助于克服現有技術的困難，實現高靈敏檢測待檢樣品。

本發明的毛細管分析柱以及基于該分析柱的LC-MS檢測方法，可以適用于基于蛋白質組學的胚胎干細胞或其他原代細胞的檢測，尤其能夠為通過低水平酪氨酸磷酸化信號的檢測實現蛋白LC-MS分析鑒定提供可行的途徑，實現快速、高效對含量較低的蛋白成分的復雜生物樣本進行分析鑒定的目的。

為實現本發明的目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供了一種毛細管分析柱(毛細管色譜柱)，所述分析柱包括柱管，毛細管整合發射尖端，填充在管腔中的填料，用于支撐填料的熔塊。