[發明專利]一種用于檢測新冠病毒N蛋白的雙抗體夾心ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 202110659663.4
• 申請日: 2021-06-15
• 公開（公告）號: CN113493508A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 馬曉飛;武鵬程;武雷;孔雙泉;金麗珠;尹長城
• 申請（專利權）人: 北京華大蛋白質研發中心有限公司
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569
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• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種新冠病毒(SARS?CoV?2)的雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒及其使用方法，所述方法基于抗體實現的，所述抗體對由如下方法篩選獲得：免疫原制備，動物免疫，陽性雜交瘤細胞篩選及建株，腹水制備與抗體純化，純化得到的22株抗體進行配對優化，最終獲得一對可以檢測SARS?CoV?2的配對抗體：包被抗體64360A#4:27，檢測抗體64360A#5:42。本發明的ELISA檢測方法，操作簡便，敏感度高，可以特異檢測新冠病毒的結構蛋白N蛋白，且不與SARS病毒N蛋白產生交叉反應，檢測靈敏度達100pg/mL。

說明書

技術領域

本發明涉及新冠病毒的檢測及診斷領域。更具體地，本發明涉及一種可以用于新冠病毒檢測的雙抗體夾心ELISA方法，在新型冠狀病毒感染的篩查，檢測和預后評價中具有重要應用價值。

背景技術

新冠病毒(SARS-CoV-2)與引起中東呼吸綜合征MERS病毒和嚴重急性呼吸綜合征SARS病毒同屬于冠狀病毒的大家族。SARS-CoV-2有一個大小為30kb的正義、單鏈RNA基因組。它的核衣殼蛋白(N)是由膜蛋白(M)、包膜蛋白(E) 以及刺突蛋白(S)組成的外膜，包裹著病毒的基因組。N蛋白是由兩個結構域組成的磷酸化蛋白，可與病毒RNA結合，參與RNA合成和蛋白翻譯，是病毒復制過程表達拷貝最多的結構蛋白，它性質穩定的特點決定了其作為病毒抗原檢測的獨特優勢。

截至目前，國家藥品監督管理局共批準新冠病毒檢測試劑15個，其中核酸檢測試劑10個，抗體檢測試劑5個，沒有批準病毒抗原的相關檢測。核酸檢測是病原物檢測的金標準，該方法對實驗室條件、檢測人員、儀器要求較高，且呈現出特異性較強，靈敏度偏弱的特點，對感染病例檢測的準確度只有30％-50％。抗體檢測試劑是檢測血清中由病毒進入人體后刺激人體產生的IgM或IgG抗體，IgM抗體出現較早，IgG抗體出現較晚，該方法可以作為核酸檢測的有效補充。對于新冠病毒核酸檢測陰性的疑似病例，可以采用抗體檢測作為補充檢測指標。對于新冠病毒核酸檢測的疑似病例，也可以用抗體檢測來協同使用。

相較于核酸檢測，抗原檢測方便、快速和低價等優勢，而相較于抗體檢測，抗原檢測無窗口期，可對剛出現感染癥狀的患者進行及時檢測。對于這種傳染性很強的新冠病毒感染，提高檢測便利程度和敏感度格外重要，而抗原檢測具有目前抗體檢測所不能替代的優勢，預期冠狀病毒感染和防治的態勢將會是長期的，高敏感檢測方法需求強烈，高親和力的配對抗體在抗原檢測產品開發中尤為重要。新冠病毒的N蛋白長度為422個氨基酸，由序列比對可知，該蛋白與SARS冠狀病毒株號為GD01的N蛋白序列(Genbank ID為AAP51234)一致性達到了90.5％，通常制備的抗體難以將二者進行區分，這增加了抗體制備的難度。雙抗體夾心ELISA 方法無論是采用傳統的雙抗體酶聯吸附免疫法、酶促化學免疫發光法或免疫膠體金試紙條法，都需要通過特異的抗體完成檢測。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一對可配對的特異性識別SARS-CoV-2病毒N蛋白而不識別SARS病毒N蛋白的單克隆抗體對。

本發明的另一個目的是提供上述特異性抗體對的制備及篩選方法。

本發明的再一個目的是提供一種檢測SARS-Cov-2病毒N蛋白的雙抗體夾心 ELISA方法及試劑盒。

在本發明的第一方面，提供了一對單克隆抗體，分別為包被抗體和檢測抗體包被抗體組成為包括：

(a)輕鏈可變區

(i)包含SEQ ID NO：01所示氨基酸序列的CDR-H1區。

(ii)包含SEQ ID NO：02所示氨基酸序列的CDR-H2區。

(iii)包含SEQ ID NO：03所示氨基酸序列的CDR-H3區。

(b)重鏈可變區