[發明專利]一種可提高大豆蚜蟲抗性基因的重組載體及其應用

有效

• 申請號: 202110648183.8
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113444740B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 姚陸銘;王彪;馬曉紅;武天龍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發明公開了一種可提高大豆蚜蟲抗性基因的重組載體及其應用，涉及植物細胞技術領域，該重組載體為pGm109?35S?GmPti5重組載體，包括植物雙元表達載體pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。公開了該重組載體在構建抗蚜蟲大豆株系中的應用。還公開了一種可提高大豆蚜蟲抗性基因在構建抗蚜蟲大豆株系中的應用，該基因為GmPti5基因，編碼蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明公開了調控大豆對蚜蟲抗性的基因GmPti5，構建重組載體，該基因過量表達能夠提高大豆對于蚜蟲的抗性，能減少農藥及人力的投入，保證大豆產量的穩定性，應用前景廣闊。

技術領域

本發明涉及植物細胞技術領域，尤其涉及一種可提高大豆蚜蟲抗性的基因的重組載體及其應用。

背景技術

蚜蟲是大豆生產中所遇到的主要蟲害之一，也是影響大豆產量的重要原因。提高大豆對蚜蟲的天然抗性不僅能保證大豆的正常生長，還能減少農藥及人力的投入，保證大豆產量的穩定性。目前生產上尚未出現抗蚜蟲的大豆品種，對大豆蚜蟲的防治仍主要通過化學防治進行。因此提高大豆自身對蚜蟲的抗性是大豆生產中亟待解決的重要問題。

不同大豆品種對蚜蟲抗性存在很大差異，抗蟲品種具有更高的蚜蟲抵抗能力。發掘和利用大豆中抗蚜蟲的關鍵基因，對于培育抗蚜蟲大豆品種具有重要意義。

因此，本領域的技術人員致力于發現及克隆可提高大豆蚜蟲抗性基因，并開發一種過量表達乙烯響應因子及其編碼產物提高大豆對蚜蟲抗性的方法。

發明內容

有鑒于現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是開發一種過量表達乙烯響應因子及其編碼產物提高大豆對蚜蟲抗性的方法。

為實現上述目的，本發明提供了一種可提高大豆蚜蟲抗性基因的重組載體及其在構建抗蚜蟲大豆株系中的應用方法；提供了一種可提高大豆蚜蟲抗性基因及其在構建抗蚜蟲大豆株系中的應用方法。

本發明提供一種可提高大豆蚜蟲抗性基因的重組載體，為pGm109-35S-GmPti5重組載體，pGm109-35S-GmPti5重組載體包括植物雙元表達載體pGM109和GmPti5基因；GmPti5基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，植物雙元表達載體pGM109中包括花椰菜花葉病毒35S啟動子、Nde I和Sal I位點；Nde I和Sal I位點位于花椰菜花葉病毒35S啟動子之后；GmPti5基因正向插入在Nde I和Sal I位點之間。

本發明還提供一種可提高大豆蚜蟲抗性基因的重組載體在構建抗蚜蟲大豆株系中的應用。

該重組載體在構建抗蚜蟲大豆株系中應用的方法包括以下步驟：

步驟1、合成大豆第一鏈cDNA：提取抗蚜蟲大豆品種總RNA后反轉錄，獲得第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模版，進行第一PCR擴增，得到擴增產物GmPti5基因全長cDNA；

步驟2、構建過表達重組載體pGm109-35S-GmPti5，以步驟1獲得的GmPti5基因全長cDNA為模版，用含有Nde I和Sal I接頭的特異性引物進行第二PCR擴增，得到第二擴增產物，第二擴增產物經過Nde I及Sal I雙酶切，回收后得到雙酶切產物，將雙酶切產物正向插入植物雙元表達載體pGM109的花椰菜花葉病毒35S啟動子之后的Nde I和Sal I位點之間，得到重組載體pGm109-35S-GmPti5；

步驟3、將步驟2得到的重組載體pGm109-35S-GmPti5通過農桿菌介導的子葉節法轉化到大豆易感蚜蟲材料中，得到轉化后的大豆易感蚜蟲材料；轉化后的大豆易感蚜蟲材料經過共培養、芽誘導、生根培養、種植，得到轉基因大豆；對轉基因大豆轉化篩選，并分析表達量，得到陽性株系；對陽性株系連續篩選，獲得穩定遺傳的抗蚜蟲大豆材料。

進一步地，第一PCR擴增引物序列為：