[發明專利]高效表達利什曼原蟲PEPCK的人復制缺陷型重組腺病毒載體

在審

• 申請號: 202110648019.7
• 申請日: 2021-06-10
• 公開（公告）號: CN113337542A
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 邢力;吳長新;潘元晴;郭凡
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N15/30;A61K39/008;A61P33/02
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

本發明屬于生物技術領域，針對目前利什曼病的現狀公開了一種高效表達利什曼原蟲磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)的人復制缺陷型重組腺病毒載體。具體為將修飾后的PEPCK基因與pShuttle?CMV載體構建的重組載體pShuttle?CMV?Leish?PEPCK和pAdEasy?1載體進行同源重組，得到的質粒載體pAd5?L.m?PEPCK經過PacI切割，轉染進人胚腎細胞293而獲得復制缺陷型重組腺病毒載體Ad5?L.m?PEPCK。經考馬斯亮藍R250染色和特異抗體抗His標簽抗體的Western blot分析表明重組腺病毒載體Ad5?L.m?PEPCK能夠高效表達PEPCK蛋白。由于利什曼原蟲磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶(PEPCK)是最近發現的最有免疫優勢的利什曼病抗原。因此本發明重組腺病毒載體Ad5?L.m?PEPCK可用于利什曼病的疫苗，從而有助于利什曼病的防控。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體為一種高效表達利什曼原蟲PEPCK的人復制缺陷型重組腺病毒載體。

背景技術

利什曼病(leishmaniasis)，又稱黑熱病。它的病原體是幾種趨內臟的利什曼原蟲。原蟲主要寄生于病人體內的巨噬細胞里，由雙翅目昆蟲白蛉為傳播媒介。臨床特征主要表現為長期不規則的發熱、脾臟腫大、貧血、消瘦、白細胞減少和血清球蛋白的增加。如不予合適的治療，患者大都在得病后1-2年內因并發其它疾病而死亡。

世界衛生組織把黑熱病列為再度回升的一種寄生蟲病。黑熱病的分布極廣，波及亞、歐、非及拉美四大洲。全球超過88個國家有黑熱病流行，約有3.5億人口生活在疫區，每年有新感染病例10萬左右，各地黑熱病的流行病學特征不盡相同。中國一直受到黑熱病的困擾，黑熱病在我國長江以北的16個省、直轄市、自治區曾廣泛流行，包括遼寧、河北、北京市、山東、江蘇、安徽、河南、湖北、陜西、山西、四川、甘肅、青海、寧夏、內蒙古和新疆。在新疆、甘肅、四川、陜西、山西和內蒙古6省、自治區，黑熱病從來沒有消失過。

防治利什曼病，世界衛生組織把疫苗的研發列為重要策略任務。過去有三代抗利什曼原蟲疫苗曾經進入到或正在臨床試驗階段，但目前均沒有證據達到世界衛生組織的有效性。第一代抗利什曼原蟲疫苗包括三個主要類型：完整殺死寄生蟲、部分分離利什曼原蟲抗原、減毒活病原體。完整殺死利什曼原蟲疫苗成本低，在人體內成功應用于I期和II期臨床試驗，充分證明了其安全性和免疫原性；然而，該疫苗未能在隨機臨床試驗(RCT)的III期取得令人滿意的結果。部分分離利什曼原蟲抗原疫苗和減毒活病原體疫苗主要用于犬利什曼病的防控。通過基因工程細胞產生的重組蛋白被稱為“第二代疫苗”。典型代表是LEISH-F1，原名Leish-111f，已進入臨床二期。這種人工蛋白是由三個基因編碼：碩大利什曼原蟲的真核硫醇特異性抗氧劑(L.major homologue of eukaryotic thiol-specificantioxidant,TSA)，碩大利什曼原蟲應激誘導蛋白1(L.major stress-inducibleprotein-1,LmSTI1)，和L.braziliensis伸長和起始因子(L.braziliensis elongationand initiation factor,LeIF)。LEISH-F3是另一種多組分疫苗，由兩種蛋白質組成：核苷水解酶(nucleoside hydrolase,NH)和甾醇24-c-甲基轉移酶(sterol 24-c-methyltransferase,SMT)。第三代疫苗的代表是ChAd63，一種猿猴腺病毒載體疫苗(ChAd63)可以有效地誘導廣泛的CD8+T細胞。這種疫苗編碼KH基因，由兩個杜氏利什曼原蟲抗原基因組成：KMP-11和HASPB。研究表明，ChAd63-KH能有效誘導干擾素-γ的產生和樹突狀細胞的活化。