[發明專利]一種利用isPLA高通量篩選單域抗體的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110641192.4
• 申請日: 2021-06-09
• 公開（公告）號: CN113528569B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 馬振毅;劉喆;殷曰苑;嚴飛;周瑞敏
• 申請（專利權）人: 天津醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/70;C12N15/62;C12N15/13;C07K16/18;C40B30/04
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明公開了一種利用isPLA高通量篩選單域抗體的方法，步驟如下：構建一個含21個隨機氨基酸序列的CDR3區域的sdAb文庫，序列的C端融合一個3×Flag標簽；共轉染細胞，固定細胞進行isPLA；隨后分選、擴增、重組，經過多輪篩選和測序后，構建依次包含谷胱甘肽S?轉移酶GST、煙草花葉病毒TEV蛋白酶切位點，識別SQSTM1的sdAb序列、假單胞菌外毒素ETA的易位結構域和3×Flag標簽的重組蛋白，在大腸桿菌中表達，隨后經過純化和酶切，即得。本方法能夠從構建的高容量sdAb文庫中篩選到特異性識別不同抗原決定簇的sdAbs，并且成本低、效率高。不涉及動物樣本或雜交瘤的制備。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其是一種利用isPLA高通量篩選單域抗體的方法及其應用。

背景技術

1993年，Hamers-Casterman等在駱駝科動物血清中發現存在2種結構的免疫球蛋白：一種是傳統的由2條重鏈和2條輕鏈組成的抗體；還有一種僅有2條重鏈(Nature.1993；363:446-448.)。只克隆該抗體的重鏈可變區，即可得到單域抗體(single-domainantibody,sdAb，也被稱為納米體，nanobody)，分子量約為15kD。sdAb結構穩定，具有較高的親和力和抗原結合能力，相對分子質量小，容易穿透組織屏障，易于生產制備和進行基因工程改造，憑借其獨特的優勢得到了廣泛的研究和關注(Journal of BiomedicalNanotechnology,2018,14(1):1-19.)。例如，它可以作為蛋白結晶過程中的分子伴侶(Nature.2011；469(7329):175-80.PNAS.2015；112(36):E4975-84.Elife.2014；3:e03239.J Virol.2017；91(3):e01443-16.Nature.2012；487(7405):119-22.)；還能和其它蛋白融合表達，在細胞內操控其功能(FEBS Lett.1997；414(3):537-40.J ControlRelease.2019；299:107-120.；Artif Cells Nanomed Biotechnol.2020；48(1):854-866.)，此外，在臨床診斷和治療中的實踐也在積極地探索中(Adv Healthc Mater.2018；7(8):e1701156.FEBS J.2021Apr；288(7):2084-2102.Nat Rev Drug Discov 2018；17(3):197-223.)。

然而，對于特定抗原找到其親和力高的抗體分子仍然面臨較大挑戰，為此，本申請人構建了基于sdAb骨架序列(complementarity-determining region 3,CDR3)區域的隨機文庫，利用原位接近連接(insituproximityligationassay,isPLA)技術篩選來特異識別任意蛋白質分子抗原的sdAb。

sdAb的抗原互補決定區(complementarity-determining region，CDR)決定其與相應抗原的親和力(FEBS J.2021；288(7):2084-2102.JCB 2015；209(5):633-44.J MolBiol.2005；352(3):597-607.)。傳統上，利用抗原免疫羊駝，分離羊駝的漿細胞，制備雜交瘤細胞，篩選出能產生特異識別抗原的sdAb的雜合細胞，用于后續sdAb分離、純化和功能的驗證。整個過程耗時長，所用實驗材料較多，費用較高，使得得到高親和力的sdAb的成功率極低。此外，基于已知抗體抗原決定區的氨基酸序列，工程化的sdAb研究也有一些報道，但這些研究是對已有抗體功能的進一步補充；而從頭尋找新的特異性更高的sdAb的嘗試還面臨較大的挑戰，缺乏在單細胞水平高親和力、高特異性的篩選方法，有待開發。

通過檢索，尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術中的不足之處，提供一種利用isPLA高通量篩選單域抗體的方法及其應用。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：