[發明專利]一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌、制備方法及應用

有效

• 申請號: 202110639403.0
• 申請日: 2021-06-08
• 公開（公告）號: CN113528409B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 彭文舫;郝怡樂
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/55;C12R1/01
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 藍曉玉

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌、制備方法及應用。本申請通過比對ZM4菌株與其他同樣攜帶內源I型CRISPR?Cas系統的菌株，內源CRISPR相關蛋白的編碼基因序列差異，找到了其Cas3蛋白的功能結構劃分。并且通過探究I?F型CRISPR?Cas系統的工作原理，設計并替換了ZM4菌株內Cas3蛋白解旋酶結構域中的一個氨基酸。將原本ZM4菌株上編碼Cas3蛋白的ZMO0681基因內的676,661號的腺嘌呤核苷酸原位替換為胞嘧啶核苷酸，使Cas3蛋白喪失解旋酶活性，轉變為只攜帶單鏈DNA核酸內切酶活性的nCas3蛋白，從而得到改造后菌株DRM2。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌、制備方法及應用。

背景技術

CRISPR-Cas是一種廣泛存在于大多數細菌和古菌中的原核適應性免疫系統，用于防止病毒或質粒等外源性遺傳物質的入侵。

該系統由RNA引導，CRISPR序列內儲存的遺傳信息會轉錄出具有特異性RNA，與Cas核酸酶結合后會在外源入侵遺傳物質的位點特異性結合，產生雙鏈斷裂并刺激宿主的修復機制，包括同源重組修復(HDR)和非同源末端鏈接(NHEJ)。這種細菌保有的免疫修復機制目前已經被開發用來作為生命科學領域常用的一種基因編輯工具。

迄今為止，CRISPR-Cas系統的分類層次大體上總共分為兩個大類和六個型。其中的1類系統，包括I型、III型和IV型，其特征是由多個Cas蛋白共同構成。Type I和Type III是最常見和多樣化的，在大量的古細菌中都有存在，在細菌中則較少出現。IV型系統缺乏CRISPR-Cas基因座的適應模塊。第2類系統，包括II型、V型和VI型，這類系統則是由一個單一的、大的、多結構域的Cas蛋白組成。每一種類型的CRISPR-Cas系統中都存在與之對應的特征蛋白。例如II型系統中具有核酸內切酶活性的效應蛋白Cas9和V型系統中的效應蛋白Cpf1。而在Ⅰ型系統中，特征效應蛋白則為Cas3蛋白。

目前由報導稱，已經在運動發酵單胞菌Zymomonas mobilis ZM4中找到并開發了一個內源的I-F型CRISPR-Cas系統(Zheng et al.；Characterization and repurposingof the endogenous Type I-F CRISPR-Cas system of Zymomonas mobilis for genomeengineering,Nucleic Acids Research,2019,47(21):11461-11475.)，并驗證出這一系統在進行單基因編輯時，達到了100％的效率。然而，文中也指出，在用該系統針對與大片段基因敲除時，其編輯效率只達到了50％。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌、制備方法及應用，目的在于解決現有技術中的一部分問題或至少緩解現有技術中的一部分問題。

本發明是這樣實現的，一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌，所述工程菌以運動發酵單胞菌Zymomonas mobilis ZM4為基礎，將編碼Cas3蛋白的ZMO0681基因內的676,661號的腺嘌呤核苷酸原位替換為胞嘧啶核苷酸；

或將編碼Cas3蛋白的ZMO0681基因內的676,209號的腺嘌呤核苷酸原位替換為鳥嘌呤核苷酸且將676,209號的腺嘌呤核苷酸原位替換為胞嘧啶核苷酸；

或將編碼Cas3蛋白的ZMO0681基因內的677,497號的胞嘧啶核苷酸原位替換為鳥嘌呤核苷酸且將677,498號的鳥嘌呤核苷酸原位替換為胞嘧啶核苷酸。

C-1T和C3T兩個堿基的改變屬于密碼子簡并性的覆蓋范圍內，不影響蛋白質的翻譯。只是為了原位替換時的操作，與工程菌性質無關。

本發明還提供了一種含nCas3單鏈核酸內切酶的工程菌的制備方法，包括以下步驟：