[發明專利]一種糞腸球菌保存方法及冷凍保存用保存劑

在審

• 申請號: 202110638687.1
• 申請日: 2021-06-08
• 公開（公告）號: CN113388522A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 張志榕;王小芬;鄭甜力;肖俊峰;陳志敏;吳賢峰;吳有林
• 申請（專利權）人: 福建傲農生物科技集團股份有限公司;亞太星原農牧科技海安有限公司;南昌傲農生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/20;C12N1/36;C12R1/01
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 蔣亮珠

本發明涉及一種糞腸球菌保存方法及冷凍保存用保存劑，該方法包括以下步驟：(1)菌液制備：將糞腸球菌接種到含有培養基的容器中，靜置培養；(2)第一次傳代：從培養后的容器中吸取菌液，并與保護劑混勻，進行冷凍，然后解凍，再吸取菌液，接種到另一個含有培養基的容器中，靜置培養；(3)第二次傳代；(4)第三次傳代；(5)分裝保存：將培養后的菌液離心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存劑，混合均勻，放置一段時間后，低溫保存。該保存劑包含以下質量百分比組分：甘油18?20％，氯化物4?5％，磷酸氫二鹽0.5?0.56％，磷酸二氫鹽0.04?0.1％，余量水，pH為8.5?9.0。與現有技術相比，本發明操作簡單，菌種穩定性強，能大幅提升冷凍保存后存活率。

技術領域

本發明涉及糞腸球菌保存領域，具體涉及一種糞腸球菌保存方法及冷凍保存用保存劑。

背景技術

糞腸球菌歸于腸球菌屬，革蘭氏陽性菌，兼性厭氧。菌體為圓形或橢圓形，呈單個、成對或短鏈狀排列，無芽孢、無鞭毛。是人及動物腸道中正常菌群的一部分，在腸黏膜上具有較強的耐受和定植能力，以及具有較強的抗逆性，能改善動物的生長性能。

糞腸球菌具有良好的抑菌能力和抗藥敏性能，對腸系菌群具有調控作用，而且對致病型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌等能起到較好的抑制作用。糞腸球菌廣泛應用于制藥、食品和飼料加工業。

糞腸球菌雖然有較強的抗逆性，但其作為乳酸菌無法形成芽孢，所以其保存的效果遠不如芽孢桿菌，目前對于其菌種的保存主要以冷凍保存為主，冷凍保存時，降溫過程中糞腸球菌的死亡率較高，導致其冷凍保存的存活率較低，同時也降低了其保存的時限，

而現有的技術一般只把重點放在保護劑配方原料上，卻忽略了菌種本身抗逆性與保存工藝、保護劑參數等因素。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種操作簡單，菌種穩定性強，能大幅提升冷凍保存后存活率的糞腸球菌保存方法及冷凍保存用保存劑。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種糞腸球菌冷凍保存用保存劑，該保存劑包含以下質量百分比組分：甘油18-20％，氯化物4-5％，磷酸氫二鹽0.5-0.56％，磷酸二氫鹽0.04-0.1％，余量水，pH為8.5-9.0。

進一步地，所述的氯化物包括氯化鈉或氯化鉀；所述的磷酸氫二鹽包括磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉；所述的磷酸二氫鹽包括磷酸二氫鉀或磷酸二氫鈉。

一種糞腸球菌冷凍保存方法，該方法包括以下步驟：

(1)菌液制備：將糞腸球菌接種到含有培養基的容器中，靜置培養；

(2)第一次傳代：從培養后的容器中吸取菌液，并與保護劑混勻，進行冷凍，然后解凍，再吸取菌液，接種到另一個含有培養基的容器中，靜置培養；

(3)第二次傳代：從培養后的容器中吸取菌液，并與保護劑混勻，進行冷凍，然后解凍，再吸取菌液，接種到另一個含有培養基的容器中，靜置培養；

(4)第三次傳代：從培養后的容器中吸取菌液，并與保護劑混勻，進行冷凍，然后解凍，再吸取菌液，接種到另一個含有培養基的容器中，靜置培養；

(5)分裝保存：將培養后的菌液離心，并去掉上清液后，向菌泥加入保存劑，混合均勻，放置一段時間后，低溫保存。

傳代時，吸取的菌液體積為上一步驟混合液的10％左右，解凍后，吸取的菌液體積為另一個容器中液體體積的10％左右。

本發明的方法是專門針對糞腸球菌而設計的，經驗證后，不具有普適性，沒有證據能夠證明這個培養、保存方法可以隨意外推應用到別的菌種當中。

進一步地，所述靜置培養的溫度為37-38℃，時間為24-36h。