[發明專利]一種nCas3單鏈核酸內切酶及其應用

有效

• 申請號: 202110638175.5
• 申請日: 2021-06-08
• 公開（公告）號: CN113528484B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 彭文舫;郝怡樂
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/10
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 藍曉玉

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種nCas3單鏈核酸內切酶及其應用。本發明提供的nCas3單鏈核酸內切酶，通過破壞掉Ⅰ型系統中Cas3蛋白的解旋酶活性區域，使其成為只具備單鏈核酸酶活性的nCas3蛋白，達到在基因編輯過程中只在靶向位點切割其中一條DNA單鏈而不會對DNA分子內另一條單鏈造成損傷的目的。以此降低Cas3蛋白在基因編輯過程中對細胞的毒性，從而提高轉化效率，獲得更多的轉化子，進而篩選得到更多編輯后的目的菌株。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種nCas3單鏈核酸內切酶及其應用。

背景技術

CRISPR-Cas是一種廣泛存在于大多數細菌和古菌中的原核適應性免疫系統，用于防止病毒或質粒等外源性遺傳物質的入侵。

近年來的研究證實，CRISPR-Cas系統在結構上由兩部分組成。首先，是有規律成簇間隔短回文重復序列(CRISPRs)，宿主可以在其中存儲入侵的遺傳物質信息。其次，是一些與CRISPR相關的蛋白質(Cas蛋白)。Cas蛋白包括由CRISPR相關基因編碼的解旋酶、核酸酶和結構蛋白。當儲存在CRISPR簇中的外源基因序列被轉錄加工成具有特定結構的pre-crRNA后，Cas蛋白會與crRNA結合，識別并切割入侵的外源基因序列。

目前，原核生物適應性免疫系統已被廣泛應用于微生物學、分子生物學等多個領域。迄今為止，CRISPR-Cas系統的分類層次大體上總共分為兩個大類和六個型。其中的1類系統，包括I型、III型和IV型，其特征是由多個Cas蛋白共同構成。Type I和Type III是最常見和多樣化的，在大量的古細菌中都有存在，在細菌中則較少出現。IV型系統缺乏CRISPR-Cas基因座的適應模塊。第2類系統，包括II型、V型和VI型，這類系統則是由一個單一的、大的、多結構域的Cas蛋白組成。每一種類型的CRISPR-Cas系統中都存在與之對應的特征蛋白。例如II型系統中具有核酸內切酶活性的效應蛋白Cas9和V型系統中的效應蛋白Cpf1。而在Ⅰ型系統中，特征效應蛋白則為Cas3蛋白。

Cas3蛋白是由cas3基因編碼的一種多功能蛋白，同時具有單鏈DNA(ssDNA)刺激的ATP酶活性、ATP依賴的解旋酶活性和一種金屬依賴的單鏈核酸酶活性。大多數情況下，其解旋酶結構域會與核酸酶結構域中位于Cas3蛋白的n端的HD位點融合，并參與目標DNA的裂解。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種nCas3單鏈核酸內切酶及其應用，目的在于解決現有技術中的一部分問題或至少緩解現有技術中的一部分問題。

本發明是這樣實現的，一種nCas3單鏈核酸內切酶，所述nCas3單鏈核酸內切酶為在野生型Cas3蛋白的解旋酶功能域上引發突變，使野生型Cas3蛋白喪失解旋酶活性，只具備單鏈核酸酶活性的nCas3蛋白。

進一步地，所述野生型Cas3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述nCas3單鏈核酸內切酶為K458A、或D608A、或R887A；

所述K458A的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相比，區別僅在于將第458位的“K”替換為“A”；

所述D608A的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相比，區別僅在于將第608位的“D”替換為“A”；

所述R887A的氨基酸序列與SEQ ID NO.1相比，區別僅在于將第887位的“R”替換為“A”。

進一步地，所述nCas3單鏈核酸內切酶的氨基酸序列為由K458A、或D608A、或R887A的氨基酸序列經過若干個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或插入，且具有相同蛋白功能的氨基酸序列。

進一步地，所述野生型Cas3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；